Bio-Rad专家Mark White，生物制药产品营销副总监，Marwan Alsarraj，生物制药部门经理，解释如何利用质量控制工具来减少基因疗法中的杂质
腺相关病毒(AAVs)已成为主要的基因治疗系统之一，因为它们能够以最小的致病性和低突变风险将有益的遗传物质运输到患者细胞中。
它们是近250项临床试验的关键组成部分，其中一些已获得美国FDA批准，如视网膜疗法Luxturna。仅在美国，就有超过400项正在进行的基因治疗试验，研究人员每天都在了解这些疗法的最佳传递系统。
为了创建基于aav的基因疗法，开发人员首先生产重组aav，其中包含所需的DNA序列，以细胞为宿主。然后，通过提取和纯化病毒颗粒，宿主细胞含有没有杂质或污染物的新序列。
但是，即使像这种有希望的方法也不是完美的。
aav的主要挑战之一是确保输送给患者的病毒载体是纯净、安全和有效的。
否则，将载体带入患者的细胞可能会使他们处于危险之中。为了确保自动驾驶汽车的安全，制造商必须采取严格的质量控制措施。
检测污染物和确定适当的病毒滴度至关重要，特别是随着生产规模的扩大，这往往会使事情复杂化。在这里，我们讨论我们在AAV发展中观察到的五大挑战。
如果属的细菌支原体污染治疗方法，它会使患者面临呼吸系统疾病的风险，因此它是一种特别需要注意的杂质。
然而，尽管风险很大(30%的细胞系被污染)，这些细菌很难被检测到，因为它们非常小，很难用标准光学显微镜看到。1
此外，它们对通常用于维持细胞系的β -内酰胺抗生素具有耐药性。应采用其他质量控制方法，如细胞培养程序、实时PCR (RT-PCR)和液滴数字PCR (ddPCR)技术来确保AAV质量。
图1液滴数字PCR (ddPCR)原理
虽然RT-PCR是用于此目的的最常用工具之一，但它可能不是最好的。这项技术依赖于一个标准曲线，通过计算样本在某一阈值发出荧光所需的循环次数而生成。
这种方法可能会引入许多人为错误，导致结果相差两倍之多。2许多专家在试图检测时转而使用ddPCR工具支原体因为它提供了绝对量化(图1)。
由于这种能力，ddPCR技术可以精确地量化支原体浓度，而不是依赖于标准曲线，因此与RT-PCR相比，在二级DNA结构或宿主细胞污染物干扰较少的情况下，提供了更灵敏的测量。
在AAV发育过程中出现的另一种常见杂质是空的或部分满的衣壳。衣壳不包含预期的序列降低了治疗的有效性。
虽然它们可能不会对患者构成严重的风险，但这些衣壳会导致治疗传递问题。由于药效降低，患者需要比正常情况下更高的剂量。
随着剂量的增加，将疗法输送到身体的某些部位可能是一个挑战——像中枢神经系统这样的小区域可能很难到达。为了防止这些困难，制造商必须监测并去除空的和部分满的衣壳，以确保大多数或所有衣壳提供预期的治疗。
为了保证基因治疗的有效性，载体应以预期的浓度存在。然而，目前用于培养这些载体的上游生物加工的标准工艺产生的浓度低于有效治疗患者所需的浓度。
作为参考，标准方法的产率浓度可达2 x 1011每毫升的载体基因组，而有效剂量为1 x 1014每毫升的向量。3.因此，病毒需要浓缩100到10000倍。这一过程也增加了批次中宿主细胞污染物的浓度。
反过来，这增加了对有效质量控制的需求，以检测和清除污染物。
尽管许多科学家认为，由于aav不含工程脂质或其他化合物，因此它们的免疫原性不如其他递送系统，但衣壳蛋白本身可以引发免疫反应。
如果发生这种情况，治疗效果可能会降低。如果病人以前接触过AAV，他们可能自然已经有了免疫反应。
我们需要更多的研究来了解空衣壳在产生这种潜在反应中所起的作用，这也是为什么我们需要能够检测和量化这些衣壳的敏感工具的另一个原因。
除了外部污染物和病毒载体本身的问题外，杂质还可能来自用于培养载体的细胞。这些细胞可能含有来自用于培养载体的致瘤细胞系的致癌DNA序列。
这些残留的序列有可能成为最终的基因治疗产品。为了解决这个问题，开发人员应该在治疗批次中测试致癌基因。
他们还应该进行单独的测试，以确定他们的疗法的基因序列是否可能导致癌症。不幸的是，一旦一个不正确的序列被包装进病毒粒子中，就很难去除，因为衣壳可以保护DNA不受核酸酶的伤害。
有一大堆杂质和污染物会使AAV的发展复杂化。随着这一治疗输送系统的成熟，了解和实施最佳质量控制措施将有助于我们实现aav的承诺。
qPCR和ddPCR技术等工具是检测许多杂质的有效方法，如支原体、载体浓度和致癌DNA。如前所述，ddPCR技术可能是两种方法中更敏感的一种。
一项研究发现，ddPCR检测单链AAV基因组的效率是qPCR的四倍。4另一项研究发现ddPCR系统可以检测到答:laidlawii即使RT-PCR产生阴性结果(图2)。5
图2:ddPCR对答:laidlawii标准。ddPCR 2-D图(上)答:laidlawii-阳性液滴突出显示在黑色虚线矩形中;1和10 CFU/mL的平均拷贝数/孔值(底部)答:laidlawii标准。ddPCR LOD为1 CFU/mL，因为所有ddPCR样本均为阳性，均≥1个fam阳性液滴/孔。误差条表示标准差(n = 12)
在寻找基因疗法中的污染物时，这种水平的敏感性和准确性是至关重要的，因为它可以帮助开发人员评估治疗效力，并确定正确的剂量，同时确保治疗是安全有效的。
与标准药物相比，基因疗法有着独特的问题。使用传统疗法，开发者可以更容易地预测活性成分的数量，而不是污染物的数量。
但是，由于病毒介导的基因疗法在制造过程中不容易控制，因为它们来自自然和生物过程，所以每批药物中究竟有什么不确定因素。
如果我们想要实现这些疗法的全部潜力，确保我们的质量控制过程是彻底和稳健的将是至关重要的。
参考文献
