生物制药产品营销副总监Mark White和Bio-Rad实验室生物制药部门经理Marwan Alsarraj建议，在生产过程中严格的质量控制可以产生更安全、更有效的疗法
1984年，一名患者接受了IL-2注射，触发她自己的T细胞扩张，并针对转移性黑色素瘤。治疗完全阻止了她的疾病，使病人保持了29年的缓解期。
她只是第一个从这种治疗中受益的人。1在此和其他免疫治疗成功的基础上，最新的CAR-T细胞疗法通过对患者的T细胞进行基因改造，使其成为靶向癌症杀手，从而进一步磨练和加强自然免疫反应。2
根据ClinicalTrials.gov网站的数据，这种非凡的方法已经激发了350多个目前正在进行的CAR-T试验。3.鉴于这些设计的前景，监管机构计划到2025年每年批准10-20种细胞和基因疗法。4
随着免疫治疗领域的成熟，开发者必须适应。这一领域还很年轻，制造“活药”还没有完全标准化。科学家需要高度敏感、准确的质量控制和质量保证工具来监测动态的活细胞，因为它们在制造过程中被操纵，以确保产品在注入每个患者时是安全有效的。
为了制造CAR-T细胞疗法，从人类血液中提取T细胞并进行修饰——通常使用腺相关病毒或慢病毒——以插入嵌合抗原受体(车)转基因到细胞的基因组中。
然后，这些细胞在生物反应器中生长，并被允许繁殖到适当的体积。然后，医生将它们输回患者体内，在那里它们表达CAR蛋白，在全身循环并杀死目标癌细胞。
当一种疗法正在进行临床试验时，每批制造的细胞可能会有很大差异。开发人员使用各种方法来生产不同的CAR-T细胞疗法，目前每种疗法的每一批都是用不同的起始材料制成的:单个患者的T细胞很可能已经接受了其他治疗，这些治疗可能已经影响了他们细胞的生长和行为。
为了增加变异的可能性，开发人员必须使用严格的质量控制措施来监控生产中的细胞，以确保安全、有效的产品。
分子方法用于测试关键元素，如CAR-T细胞效力，持久性和污染物的存在。这些质量控制实践使效益最大化，使对患者的伤害风险最小化，并促进最佳的临床试验结果，以提高疗法进入市场的机会。
实验室条件和患者细胞的坚韧性会影响CAR基因在任何给定批次中的整合效率。因此，开发人员必须监控细胞的车转基因拷贝数，以避免给病人注射拷贝过多或过少的细胞。
如果CAR-T细胞有太多的车转基因后，患者出现严重的、可能危及生命的毒性反应的风险增加。5
相比之下，如果一批细胞不吸收任何副本，则无效。美国食品药品监督管理局表示，CAR-T细胞应该携带一到四个转基因副本，以达到平衡。6
转基因拷贝数可以使用多种方法进行监测，但开发人员历来倾向于使用qPCR来实现这一目的。不幸的是，由于这项技术不够准确或精确，无法追踪小浓度的转基因DNA，这种偏好会增加患者的健康风险。
qPCR只能估计转基因拷贝数。该技术依赖于实验室工作人员对样品进行连续稀释以生成标准曲线，这一过程不太敏感，因为它容易受到人为错误和可变性的影响。
由于这一限制，qPCR不能精确到每个细胞一个基因拷贝，也不能可靠地测量CAR-T细胞是否含有该基因的安全拷贝数车转基因。
相反，所需的灵敏度可以通过水滴数字PCR (ddPCR)实现，这是一种用于绝对核酸定量的方法。ddPCR的精确性和敏感性使其能够将转基因拷贝数量化到一个拷贝，并非常适合解决CAR-T细胞开发和制造过程中的其他挑战，如CAR-T持久性和批量污染。7
为了进行ddPCR检测，20µL的核酸样本被分割成20,000纳升大小的液滴，每个液滴含有一条或几条核酸链。
实际上，可以将这些示例看作是同时运行的数千个单独示例，其中一些示例包含车转基因。
独立的反应发生在每个液滴中，但扩增和荧光信号的产生只发生在含有转基因的液滴中。液滴在液滴阅读器中被量化，它可以用来推断准确的数据车那批细胞中的转基因浓度。
ddPCR优越的敏感性已在实验台上得到证实。8中国武汉华中科技大学的研究人员比较了ddPCR和qPCR的关键性能参数。
他们评估了每种方法量化DNA标准和接受CAR-T细胞治疗患者血液样本的能力。他们发现ddPCR在用来测量稀释物时更敏感车DNA标准，检测低至3.2拷贝/mL，而qPCR无法检测到如此低浓度的转基因。
同样，在测量时车qPCR的检测限为20 copies /次，而ddPCR的检测限为5 copies /次，具有较好的重复性和再现性。
除了效力，CAR-T细胞的持久性——细胞在患者体内存活的时间长度——必须进行微调，以优化治疗效益。
CAR-T细胞被注入患者体内后，它们会在血液中循环，摧毁遇到的任何癌细胞。这些细胞必须在治疗后的几个月内保持活性，才能有足够的时间来完成它们的工作。
然而，重要的是它们不能活得太久。CAR-T细胞即使在癌症进入缓解期后仍然存在，可能会导致不必要的副作用，如神经不良事件。8
医生可以通过使用ddPCR来测量血液中的CAR-T细胞，跟踪CAR-T细胞随时间的持久性，将所得数据应用于优化治疗的安全性和有效性。9
制造商还必须确保用于生产CAR-T细胞的病毒载体不能复制，并在患者体内无限期地存在。
这种情况将导致严重的健康后果。这一事件尚未在人类身上有记录;但作为一种保障，FDA建议制造商在整个生产过程的几个阶段以及治疗后在患者血液中检测具有复制能力的慢病毒。10
由于其高灵敏度，ddPCR技术是一种理想的工具，即使是检测极低水平的复制能力病毒，所以任何实例都可以在细胞引入患者之前筛选出来。11ddPCR检测也可以在每个阶段用于筛选CAR-T细胞批次的其他微生物污染物。
随着免疫治疗领域的发展，CAR-T细胞治疗的发展将变得更加微妙，它将需要质量控制测试方法来匹配。
目前，FDA已经批准了5种用于治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤的CAR-T疗法，但该领域正在获得发展势头，使CAR-T细胞对抗实体肿瘤，并开发新一代CAR-T设计，以提高治疗更广泛的癌症的能力。12 - 14
需要对这些新的治疗策略进行评估，以预测它们在体内的功能。就其核心而言，ddPCR是一种高度通用和敏感的核酸量化方法，可以提高制造过程每一步的精度，使其与当前未来CAR-T细胞疗法的安全性和有效性非常匹配。
通过严格的生产实践、质量控制等，CAR-T开发人员可以与监管机构合作，继续提高CAR-T细胞制造的严格程度。通过他们的工作，他们将继续为市场带来更多创新的拯救生命的疗法。
参考文献
