鉴于美国FDA在2022年批准了25种新的细胞和基因治疗产品，基于基因的疫苗和疗法现已进入主流制药行业。然而，对基于基因的策略日益增长的兴趣给制造商带来了压力，要求他们证明最佳的疗效和安全性
SCIEX基因治疗和核酸高级全球营销经理Kerstin Pohl报告说，实现这一目标的主要障碍之一是在生产过程中形成的宿主细胞蛋白(HCPs)。
HCPs是与过程相关的杂质，可以为宿主细胞提供多种功能，如基因转录、细胞生长和增殖。它们通常在生产过程中与药物或疫苗传递载体相互作用时释放。
细致的提纯是必要的，以减少在细胞收集过程中的杂质水平;然而，如果一些HCPs与最终产物结合或具有与之相似的物理化学性质，它们仍然可以与最终产物共化。当集成到最终产品中时，HCPs会对质量、耐久性和安全性产生负面影响。
最近的一个例子是在接受病毒载体COVID-19疫苗的个体中发生疫苗诱导的血小板减少综合征(VITT)血栓。VITT的特点是在大脑和其他关键器官中形成血凝块，每10万人中就有一人患有VITT。1
当德国格赖夫斯瓦尔德医学大学的研究人员调查腺病毒载体疫苗的含量时，他们发现了大量的丙肝病毒。2
据Alphalyse的联合创始人Thomas Kofoed博士说，HCPs的影响可以通过几种方式表现出来。“HCPs可能非常关键，因为它们可能具有生物活性，干扰药物的作用，或者更糟的是，直接作用于患者。即使HCP没有生物活性，它也可以作为一种佐剂，提高患者的不良免疫反应，从而导致多器官功能衰竭。”
今天，HCPs被认为是一种关键质量属性(CQA)，因此必须了解和监控它们的存在和组成。未能监控和预防HCPs可能导致产品生命周期的混乱和产品暂停。
考虑到产品暂停和延迟的影响，制造商有兴趣在整个开发的每个步骤建立可靠的HCP测定。
用于HCP分析的免疫分析
迄今为止，酶联免疫吸附试验(ELISA)因其易于使用、敏感性和通量能力一直是HCP检测的基准。然而，这些优势被与覆盖率、可重复性和开发时间表相关的关键问题所掩盖。
由于elisa依赖于动物(如鸡或兔子)中产生的大量高亲和力抗体来检测HCP，因此无法概括整个HCP的情况。特别是小尺寸和免疫原性较低的蛋白质，它们可能通过降解药物或稳定赋形剂来影响药物质量，可能被elisa忽略。
另一个问题是，当药物中含有HCPs时，用于产生抗体的动物与人类患者的免疫反应存在差异。例如，特定的HCP可能对人具有高度免疫原性，但依赖动物源性抗体的ELISA无法捕获，反之亦然。
此外，大多数已建立的elisa监测HCP的总数量(百万分之一)(ppm或微克HCP每克药物)，如果总体测量量保持不变，这将导致对成分变化的盲目。
另一个挑战与使用的抗体批次之间的差异有关，这显著降低了elisa在HCP分析中的可靠性。这些缺点是众所周知的，并通过使用正交方法学来补充elisa。
然而，最近的大流行带来了新的挑战。基于寡核苷酸的药物，如基于病毒载体的疫苗或疗法，正在各种不同的细胞系中生产。除了细胞系之外，病毒载体的类型本身也对最终产品中与工艺相关的杂质的组成有很大影响。
虽然传统的elisa检测HCP主要集中在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的蛋白治疗，但新的方法显示出明显更高的可变性。
因此，现成的检测方法并不容易获得，新的elisa试剂盒的开发时间长达数月或数年，无法跟上快速解决疫苗或药物威胁的全球需求。
这促使制药公司寻求正交方法来识别关键的HCP，并在药物和疫苗开发过程中监测HCP的数量，从而具有更高的灵活性。
详细HCP分析的正交方法
液相色谱-质谱(LC-MS)是一种正交的HCP检测方法，可以对样品中的HCP成分进行整体定量分析。它是一种强大的工具，受益于使用液相色谱分离杂质和高分辨率质量检测器来识别和量化单个HCPs，包括低丰度HCPs。
与ELISA不同的是，它不依赖于蛋白质特异性抗体，也不需要广泛的免疫和产品特异性测定开发用于HCP检测。因此，LC-MS分析可以在很短的时间内完成，并从一种产品转移到另一种产品，而与之相反，ELISA的抗体制备可能需要几个月的时间，而且是细胞系特异性的。
LC-MS检测的另一个好处是能够通过识别和定量单个HCPs和其他杂质(如细胞培养基成分)来告知发育过程。通过更有效地了解细胞培养基的组成，可以提高产量，并且可以有效地优化昂贵的下游纯化过程，并由数据驱动。
此外，LC-MS方法为HCP分析提供了灵活性，这意味着制造商可以进行比较LC-MS分析，以了解由于上游步骤的修改而导致的HCP剖面的变化。从这个角度来看，LC-MS可以加强过程控制策略，以降低可能被elisa忽略的安全风险。
综上所述，LC-MS可以使制药公司以一种高效的方式优化和降低过程风险，特别是在基因治疗和下一代疫苗开发方面。
LC-MS方法的进展
尽管LC-MS方法与elisa相比具有优势，但需要进行几次升级才能获得更高的准确性、灵敏度和通量。最终目标是尽可能多地识别HCPs(包括低丰度蛋白质)，并具有相关的通量。
为此，LC-MS采用了一系列先进的技术，以达到最大的灵敏度和一致性。
高分辨率质谱(high -resolution mass spectrometry, HRMS)能够准确识别和相对定量HCPs，具有高分辨率和高质量精度，提供初步概述。这在用HCPs分析复杂样品时尤其有用，由于其相似的物理性质，HCPs与最终产品溶蚀。
通过HRMS，可以生成一个预定义的HCP目标列表，以便在下游制造阶段进行监控。
尽管有这些进步，HCP分析的其他挑战是偏差和缺乏可重复性。更具体地说，鸟枪蛋白质组学方法采用数据依赖获取(DDA)。尽管这样的分析有利于检测丰度高的HCPs，但它有丢失低丰度高的HCPs的风险，并且由于基于随机性质的运行之间的差异而危及分析结果的可信度。
相比之下，SCIEX公司开发的SWATH DIA(数据独立采集)是一种更加无偏倚的MS采集方法。Alphalyse的Thomas Kofoed总结了SWATH DIA的意义:“SWATH DIA的美妙之处在于，你可以获得所有肽的数据，而无需事先知道要寻找什么。”
基于DIA技术，SWATH DIA旨在进行全面的样本分析，以检测和量化样本中每一个可检测到的HCP。与DDA不同的是，在给定的时间点检测一定数量的分析物，SWATH DIA收集所有可检测HCP的数据，使所得的HCP配置文件更加一致和可重复性。
这也意味着制造商可以回顾性地重新分析相同的MS数据。SWATH DIA为科学家提供每个样本的指纹，可以在科学界获得新见解时进行存储和评估。
一旦确定了HCP，并且需要具有一流灵敏度的更高通量，就可以将HCP目标的进一步跟踪转移到三重四极杆LC-MS，不仅具有高鲁棒性，而且具有快速分析和多路复用功能。然后可以有效地监控HCP配置文件中的更改。
多反应监测(MRM)能够在一次注射中分析大量HCPs并同时定量，同时保持定量下限(LLOQs)在0.02-4.50 ppm范围内的灵敏度。这扩大了可以在短时间内检测到HCPs的范围。
LC-MS能取代ELISA作为释放法吗?
Alphalyse已经成功使用SCIEX仪器进行了世界上第一个通过GMP认证的HCP检测，用于COVID-19疫苗增强剂的释放测试。3.
LC-MS与传统elisa相比具有成为未来标准释放检测方法的潜力，特别是在需要快速开发HCP检测方法的时候。最初，LC-MS被认为是一种补充和加强ELISA结果的正交方法，这仍然是正确的。
然而，开发产品特异性ELISA试剂盒可以将项目时间延长到一年或更长时间，这在快速向患者交付至关重要的情况下是不可取的。由于向市场提供基因疫苗和疗法的紧迫性，就像最近的大流行一样，LC-MS比以往任何时候都更有可能成为HCP分析的基准。
FDA仅通过LC-MS数据就批准了一项研究性新药(IND)申请，为这种新方法奠定了基础。该制药公司通过Alphalyse提交了质谱数据，以分析其生物制剂中的HCP成分，并在没有额外的ELISA数据的情况下获得了FDA的批准。
这是将LC-MS集成到GMP中的一个重要转折点，它可以帮助监测新剂型制造中的关键HCP和污染风险。
未来的HCP分析和超越
然而，工艺相关杂质的评价不能局限于最终药品。从产品开发的最初阶段开始，杂质分布和培养条件就可以被监测，从而更有效地生产药物，降低成本，使公众能够获得新药。
基于生产系统的高可变性的杂质谱的动态性质需要适应性和可比性的测定，可以作为整个开发过程中的检查点。这将最终帮助研究人员和制造商识别关键因素，以最大限度地减少与工艺相关的杂质，了解与特定杂质相关的风险，并最大限度地提高产量。
在早期获得的知识越多，以后需要的工艺更改就越少，这有助于加速制造和向市场交付。
最终，更好地理解HCP内容可以帮助简化更有效的净化工作流程。例如，目前的纯化程序涉及通过色谱吸附剂结合产品，而其余部分(包括HCPs)则通过。然而，一些HCPs倾向于与药物结合(搭便车蛋白)，不容易被去除。
目前的研究通过识别和结合特定HCPs的配体靶向捕获HCPs来解决这一问题。4正确的配体库选择将依赖于HCP身份的知识，这加强了基于lc - ms分析的需求。
展望未来，下一个挑战是促进LC-MS揭示的HCP数据的解释。目前仍缺乏关于个别HCPs对质量和安全的确切影响的信息。例如，已知脂肪酶可以降解治疗产品的表面活性剂，即使是微量的，加速药物变性，减少货架寿命。5
相比之下，人们对许多其他HCPs的影响仍然知之甚少。为了更好地了解具体的HCP影响，研究必须侧重于开展比较基准研究，以确定最有害的HCP物种。随着hcp特定知识池的扩大，考虑到个体hcp的风险，可能会设置可接受的限制。
鉴于下一代疗法和疫苗的高度动态性质，灵活的检测方法——可以检测、识别和量化与过程相关的杂质，而不需要漫长的开发时间表——变得越来越重要。
这最终推动了对LC-MS功能的需求，最近批准LC-MS检测用于病毒样颗粒疫苗助推器的释放测试，可被视为一个范式转变:加快对患者的速度的里程碑。3.
参考文献
