确保药品和营养药品生产过程中微生物监测的监管准则的符合性，需要对监管环境和可用于微生物鉴定和差异菌株分型的不同方法有全面的了解
微生物鉴定是生产药品或营养品的非无菌设施的关键。Accugenix回顾了用于环境监测方案的现代识别方法
对于药品、膳食补充剂或营养保健品的制造商来说，细菌、丝状真菌和酵母的存在通常是令人担忧的原因。然而，一个设计良好的环境监测(EM)计划应该在产品污染发生之前检测到这些微生物的存在。
当从生产设施中回收细菌或真菌分离物时，重要的是能够准确地识别生物体的物种和可能的菌株水平，以跟踪污染的潜在来源，减轻污染并避免产品释放的延误或完成调查。
准确的微生物鉴定需要显著和持续的流程改进，在解释数据方面的熟悉和专业知识，一致的合格分析方法和及时更新生物文库。无论使用何种方法，这些信息的可靠性或准确性都与所使用的参考库相同。为了正确识别EM程序中大部分未知分离物，文库必须包含与所涉及的制造环境相关的所有物种。1
此外，不断更新文库并纳入新的条目以跟上不断发展的微生物世界是至关重要的，在这个世界中，分类法的变化和新物种的描述每天都在发生。
根据FDA2和粮农组织3.指南、对关键成分、区域和人员的微生物监测应包括对分离物的常规鉴定。一般来说，目前在商业环境中使用的方法有三种:基因型、蛋白质型和表型(见图1)。
图1:DNA测序的基因型鉴定提供了最大的准确性和可重复性
FDA指出:“基因型方法已被证明比传统的生化和表型技术更准确。这些方法对于失败的调查特别有价值(例如不育测试;介质充满污染)。4基因型鉴定方法包括对微生物核糖体RNA基因(16S, ITS或D2)的不同区域进行测序，从而进行物种或亚种水平的鉴定。
用于EM项目的商业细菌鉴定的一种新兴蛋白质分型技术是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(或MALDI-TOF)质谱法，该技术使用核糖体蛋白光谱指纹来鉴定细菌的物种水平。表型技术使用生化反应或细胞表面成分组成来识别微生物。
每种技术都有优点和缺点。关键是平衡技术的成本效益，保持高水平的准确和可重复的识别，同时坚持制造指南和最大限度地控制生产环境。
对于未知微生物的鉴定，DNA测序快速提供了比单纯依赖视觉表型特征更准确、更可靠和可重复性的数据。这是因为基于序列的结果不依赖于生物体的年龄和健康状况、生长条件或辅助测试。事实上，样本可以是可活的或不可活的培养物，也可以只是从微生物中收集的基因组DNA物质。
基因型鉴定
基因型方法使用核糖体RNA (rRNA)区域的比较测序。核糖体DNA序列用于微生物分类学分类已经实践了几十年，因为该技术本质上是稳定的，因此可以为分类和鉴定提供可重复的数据。
在所有生物中，核糖体包含不同大小的rrna，这些rrna是由生物体基因组中的核糖体操纵子转录而来的。rrna折叠成复杂的三维结构，并被纳入复杂的蛋白质- rna复合体，这对核糖体功能和细胞存活至关重要(见图4)。
图4:大肠杆菌16S核糖体RNA结构
细菌分离物是使用16S rDNA区域进行鉴定的，因为它在细菌中普遍分布，并包含物种特异性的可变区域。真菌的鉴定，特别是丝状真菌的鉴定，历来是一项非常困难的任务。由于需要大量的经验和时间来准确地识别丝状真菌到物种水平，通常的做法是将这些生物识别到属水平，或者在某些情况下，简单地将它们识别为“霉菌”。真菌鉴定的遗传方法提供了一个更可接受的，可靠的和快速的鉴定物种水平。
内部转录间隔区(ITS2)是由真菌分类学家测序的核糖体DNA区域，因为它在近亲物种之间比真菌中的其他rDNA区域有更高程度的变异。5
为了进行细菌或真菌的基因型鉴定，通过PCR扩增rRNA基因的靶区并测序(见图3)。然后对序列数据进行分析，并在文库数据库中按照与相关序列的遗传距离增加的顺序进行比对，以实现身份匹配。由于对数据的解释和与序列进行比较的数据库都是识别过程的重要部分，因此在选择识别系统或提供者时，不要忽视数据分析方法和库覆盖范围是很重要的。
图3:DNA测序图谱
系统对数据的解释可以是全自动的，也可以是手动的。人工数据分析和校准是非常可重复的，并能够纠正标准测序异常和序列变化，这些异常和序列变化可能导致数据出现混合或质量较差。在全自动分析程序中，质量较差的数据通常会被截断，这可能导致对数据的错误解释和对EM分离物或从最终产品中提取的生物负荷样本的不正确识别。
proteotypic识别
在蛋白质组学(专门研究由基因组编码的全套蛋白质的领域)中，“蛋白质型”描述了用于识别特定蛋白质的肽序列。在微生物鉴定中，“蛋白质型”是用来表示用于鉴定特定微生物的蛋白质谱。对于经常需要识别微生物的行业来说，理想的技术是准确、可重复、快速和廉价的技术。
质谱法已经证明了表型系统的准确性和再现性的提高
MALDI-TOF质谱具有所有这些特征。这种蛋白分型方法已经证明了表型系统的准确性和再现性的提高。7对细菌样本的分析产生独特的蛋白质光谱指纹，然后将其与经过验证的数据库进行比较以进行识别。该谱由细菌的核糖体蛋白质组成，由DNA翻译而来，但不受表型方法中所见的表达可变性的影响。这些核糖体蛋白分子是组成性表达和结构的，因此它们在细胞中始终以非常高的水平存在。
MALDI-TOF分析来自新鲜培养物的少量细菌样本，该培养物悬浮在含有基质的溶液中，然后干燥到目标板上。平板放置在真空源室中，用脉冲激光束照射。电离过程利用基质吸收激光能量，同时保护蛋白质并将离子转移到完整的分子中。蛋白质从基质中释放出来，以带电分子的形式进入气态。这些离子在电场的作用下加速，然后根据它们飞行一段特定距离所需的时间——飞行时间(TOF)——进行分离。
离子的质量越低，到达探测器的速度就越快。从这一过程中产生的蛋白质光谱或指纹，然后与已知细菌的光谱库进行比较。为了有效的识别，库需要包含在制造环境中发现的相关生物，并且必须不断更新以包括新的生物和分类学变化。
对于不需要全序列数据的情况，例如常规监测，但仍然需要可重复、准确、具有成本效益的识别时，MALDI-TOF技术是一个很好的替代方案，并得到了强大的、相关的EM程序库的支持。然而，由于在文库数据库开发方面鉴定生产环境中发现的微生物的技术尚处于起步阶段，当不能用MALDI-TOF进行鉴定时，建议采用使用已证实的rDNA测序方法的多相方法。
表型鉴定
有多种系统使用表型特征进行微生物鉴定。这些系统已经使用了几十年，并根据生化测试的结果(如糖发酵)或生理特性(如盐或pH值耐受性)来区分生物体。一种表型方法提供基于提取和甲基化的细胞脂肪酸的微生物鉴定。所得的甲酯用气相色谱法分离，并将其模式与数据库进行比较。
所有这些表型系统都需要一个健康的有机体，根据所使用的技术，可能需要或不需要在特定的培养基上培养，并需要辅助测试，如革兰氏染色，以实现鉴定。该系统易于使用，具有高通量，主要用于临床环境。然而，从生产环境中分离出来的微生物在药典培养基上可能会受到生理压力，可能无法完全表达其表型或生化特征，从而导致错误的鉴定。
对于许多生物来说，传统的表型鉴定是有问题的。鉴定可能依赖于培养生物体的介质和温度，并可能导致对检测结果的主观解释和较高的不准确鉴定率。并不是所有的菌株在一个给定的物种一致表现出一个特定的特征，从而限制表型鉴定方法。此外，用于支持表型鉴定的图书馆数据库通常是有限的，而且是针对临床分离株的。
表型反应在微生物质量计划中仍有作用
尽管存在重大缺陷，但这些方法在微生物质量规划中仍然发挥着作用。表型反应的结果可以帮助确定生物对产品的生化活性，以及在该生物存在的情况下产品的稳定性。了解生物体的营养需求可以为控制或消除环境中的生物体或保存产品提供见解。
总之，目前可用的鉴定方法从基因型和蛋白质型到表型，其中16S和ITS2测序分别是细菌和真菌鉴定的金标准，特别是当结合参考质量解释方法和专注于与膳食补充剂和其他制造业相关的生物的库时。
图2:MALDI-TOF核糖体蛋白谱
采用基于蛋白质型maldi - tof的鉴定方法为常规监测方案提供了一种额外的高度准确、快速和廉价的选择。当鉴定是基于表型特征，如生化分析，方法更容易出错，可变和主观。
电磁方案应以可重复的方式检测微生物，以便有效监测环境中的控制状态。一致的方法将产生一个识别历史，允许全面的数据比较和解释。DNA测序提供了最一致和最明确的数据集，在实验室与实验室之间和随着时间的推移是可重复的。
基因型和蛋白质型鉴定不同于表型鉴定，表型鉴定可能受到基因表达差异的影响，从而导致不同的特征。此外，DNA序列是稳定和不变的，是一种识别工具，以及可用于跟踪和趋势的微生物的唯一描述符。
应变打字
在工业环境中，如膳食补充剂生产，菌株分型或微生物特征是EM计划的重要组成部分。对益生菌和营养保健品工业同样重要的是确认用于生产的特定菌株。
虽然标准的基因型和蛋白质型鉴定方法提高了在物种水平上准确和一致地识别、跟踪和趋势微生物的能力，但仅靠这些方法无法解决一些常见微生物的问题。此外，菌株分型是在重大偏移或不育失败的情况下最好的资源，在这些情况下，对菌株水平的表征是至关重要的。
亚种水平的微生物鉴定或菌株分型，以及密切相关的物种之间的区分，是一个具有挑战性的目标，但也是必要的，因为这种分析对调查根本原因非常重要。一些常用的方法用来区分密切相关的菌株比较生物通过考虑他们的基因型，表型，血清学，空间或时间特征。
虽然这些特征的组合可以导致亚种水平的鉴定，但多个特征的分析增加了区分分离株所需的时间、劳动和费用，以及增加定性和主观分析可能产生的错误。
两种公认的方法被用于精确和重复地区分密切相关的微生物:核蛋白分型和单位点和多位点序列分型(S/MLST)。
核蛋白分型是一种自动化的过程，用于细菌分离物的特征和评估同一物种的菌株之间的遗传关系。这种基于片段的技术利用限制性内切酶(通常是EcoRI和PvuII)来靶向和切割核糖体RNA基因的区域。DNA片段被凝胶电泳分解，化学发光探针被用来观察条带模式，从而得到细菌的独特指纹。
图案或指纹与数据库中的其他图案或指纹进行比较，并分配给RiboGroup进行特征描述。这种指纹可以用于亚种或菌株水平的跟踪。这些模式也可以在不同的时间从不同的样本中生成。可以生成操作环境的历史记录，并用于确定历史分离物与当前分离物之间的相似或不同程度，作为跟踪污染源调查的一部分。
通过观察高度可变的单个或多个位点，实现更高的分辨率
在商业环境中出现了一种更强大的方法，在应变水平上增加了辨别能力。这种提高的分辨率是通过观察基因组中高度可变的单个或多个位点(区域)来实现的。通过结合标准的基因型鉴定方法，如基于16S序列的分析，与多位点或单位点序列分型(SLST)，有可能解决一些最难以趋势和跟踪的生物，例如，在膳食补充剂领域。
SLST和MLST是公认的、高度准确的基于序列的方法，可用于区分密切相关的微生物，为解决亚种或菌株水平上的差异或相似性提供数据。由于S/MLST的基础是建立在DNA测序结果的基础上，DNA测序结果易于编目和引用，因此这些技术具有高度的可重复性、明确性和可扩展性。考虑到S/MLST在实验之间以及随着时间的推移的可重复性，这些方法可以用于确定从一个区域恢复的分离物是否与另一个分离物相同或不同——这一特性允许高分辨率的趋势和跟踪项目。
S/MLST方法涉及对微生物鉴定标准区(16S, ITS2或D2)以外的1 ~ 10个靶基因进行测序。已知这些目标基因包含中度到高度可变的DNA序列，是蛋白质编码基因或管家基因，编码细菌正常细胞功能所需的蛋白质。通过使用基因序列，而不是酶电泳中的基因产物，可以检测到更多的变异，从而导致每个位点有更多的潜在差异。
多个位点的添加提供了更多的变异，以进一步区分密切相关的菌株。测序后，来自多个基因目标的所有序列被连接(端到端放置)，对齐并与来自其他生物的序列进行比较。
这种比较可以计算微生物之间的分化/保守水平，并使用进化系统发育树进行显示。目标是确定基因组合，可以提供高水平的可变性，以分化到菌株或亚种水平。
亚种或菌株级别的鉴定可以明确地跟踪污染源或确定地验证生产菌株。
趋势和跟踪
膳食补充剂、营养保健品和其他产品生产的新监管准则要求进行检测，以确定原材料的微生物质量、最终产品的纯度和建立质量方案，确保生产过程得到充分控制，以防止最终产品和生产环境受到污染或掺假。1、2、3、7
对原料、最终产品和生产环境中的微生物种群进行彻底、准确和可靠的识别，可以快速和明确地解决无菌故障、警报和其他问题。
来自EM采样点的数据应反映操作方面的考虑，并应主动用于创建跟踪和趋势报告，提供有关制造区域内环境控制状态的详细分析。
图5:用EcoRI和PvuII酶切后自动核型生成的条带图
微生物区系的任何重大变化都应在审查持续监测数据时予以考虑，并用于影响缓解过程和确定根本原因的短途旅行调查。6
使用最准确的微生物鉴定方法，同时对制造工厂进行网格研究并进行常规筛查，可以识别和鉴定重复出现的同一生物体。同样，在设施的某些区域发现的微生物数量的增加可能表明HVAC系统或其他微生物污染源的破坏。从该地区发现的生物类型的变化可能有助于确定污染源。
EM数据可以与产品生物负荷数据进行比较，比较结果可以影响产品开发、工艺验证、生产和不间断的供应链。通过及时管理和审查EM趋势数据来确保产品质量，有助于保持对制造过程和设施的控制。
可靠的微生物鉴定系统需要为跟踪和趋势提供一致和准确的结果。对同一分离物提供不一致的识别或不提供识别的识别方法对于跟踪分离物的来源或生成趋势报告都是无用的，并且可能导致错误的补救工作。此外，如果对益生菌进行了健康声明，则应声明作为声明主题的益生菌微生物的拉丁名称(即属，物种和菌株名称)。3.因此，一致的菌株分型对于益生菌行业来说是至关重要的，以确保在生产中建立准确的微生物菌株。
用于鉴定的基因型方法是基于生物体的rDNA，每300万年只会出现一个核苷酸突变。DNA序列是生物体的一个不变的描述符，并为跟踪和趋势提供了一个优越的工具。通过在EM程序中使用基因型方法，将获得微生物生态学的序列，如果由于分类学的发展而对生物体进行重新分类，则仍然可以跟踪该生物体，因为序列不会发生变化。
如果发生重大偏离，无菌故障导致产品暂停或生产停止，通过菌株分型对生产环境中的微生物种群进行彻底表征是寻找污染物的首选方法。仅使用生物的属和种名称的调查程序可能无法提供足够的信息来在调查中得出明确的结论。
图6:基于MLST组合基因靶点的P. acnes系统发育树
如果存在多种菌株作为污染来源的可能性，单靠物种名称可能无法提供适当的证据来制定对污染事件的反应。很多时候，有必要将微生物区系区分为亚种或菌株水平，以明确确定污染源。一旦产生了一个彻底的遗传描述，它可以有助于确定根本原因，从而允许补救的情况，并确定一个纠正行动计划在更及时的方式。
确保在膳食补充剂和益生菌生产过程中符合微生物监测的监管指南，需要准确识别生产设施的微生物环境和产品成分中的微生物。识别的准确性是关键，取决于生成和解释数据所用的方法以及作为参考的数据库。
基因分型方法被认为是鉴定和菌株分型的金标准，但新的基于质谱的技术为常规监测提供了一种可靠的替代方法，可以精确地进行细菌鉴定到物种水平。当这些一致的、合格的方法与相关的、最新的、经过验证的库相结合时，从生产环境到物种或菌株级别的生物识别是无与伦比的。
通过使用可靠的方法来获取标识，您可以确定跟踪您的环境中的生物体或您的产品中的生物体将是准确和一致的，并有助于记录生产环境的控制，并导致整体品牌保护和消费者信心。
参考文献
1.细菌文库列表与比较。白皮书，Accugenix(2011)。
2.FDA法规21 CFR Part 111 -膳食补充剂生产、包装、标签或保存操作的现行良好生产规范(2011)。
3.1994年膳食补充健康和教育法案。
4.粮农组织/世卫组织联合工作组会议，《食品中益生菌评价准则》(2002年)。
5.FDA法规21 CFR Part 211 -现行药品生产质量管理规范(2011)。
6.ITS DNA测序用于真菌鉴定。白皮书，Accugenix(2010)。
7.Accugenix公司的AccuPRO-ID解决方案白皮书，Accugenix(2011)。
本文基于Accugenix发布的技术说明。