酶催化剂的使用对药物成分的合成产生了真正的影响，使人们有可能极大地改善一些合成，甚至制造出一些原本不可能或不实际合成的分子。流动反应器在生物催化中的应用面临着来自反应混合物的非均质浆液性质以及气体和液体处理问题的挑战。但生物催化反应的连续制造方法的研究正在进行。
就产量而言，酶的使用对药物成分的合成产生了重大影响。Sarah Houlton博士强调了最近的一些成功。
近年来，以酶的形式利用自然力量的能力对药物成分的合成产生了真正的影响。这些白色生物技术的应用使得改进某些合成技术成为可能——通常是戏剧性地改进——甚至制造出一些原本不可能或不实际合成的分子。
许多标准的化学反应现在都可以用酶催化剂来实现。荷兰代尔夫特的CLEA技术实验室最近的一个例子是使用假单胞菌stutzeri脂肪酶，或PSL，进行氨解反应。1它被证明在空间受阻的基底上特别有效。目前进行氨解反应的常用技术主要使用酸氯化物或偶联试剂。这些往往是非催化的，原子效率不高，有毒或腐蚀性试剂或副产物。使用酶催化剂将提高这一过程的绿色认证。
研究人员采用了一系列体积较大的甲酯和胺作为底物——酰基供体被激活为甲酯，以避免胺和羧酸之间形成盐。作为比较，同样的底物也用Novozym 435进行了固定化处理南极假丝酵母而CAL-B酶在以2-苯丙酸甲酯为酰基供体的氨解反应中效率更高，对于仲胺，PSL效果更好，就像它对哌啶一样。
无论是t-丁胺、二异丙胺，还是羰基α位置较大的酯类。该团队推测，脂肪酶在酰基和胺伙伴方面表现出的相对广泛的底物范围可能使其成为温和条件下合成胺的一种绿色通用方法。
定向进化等分子生物学工具也可用于提高酶的生产力和底物特异性，高于野生型酶。
转氨酶是另一类重要的酶，因为它们能够制造对映纯胺，而对映纯胺是制药部门的常见中间体。自然界中发现的大多数转氨酶对s立体化学具有选择性，试图通过基因工程合成有用的r选择性ω-转氨酶的努力只取得了有限的成功。因此，r -胺的生物催化方法在很大程度上依赖于外消旋混合物的动力学拆分，使用s选择性转氨酶去除“错误的”异构体。但当然，这使得最大可能的收益率为50%。
自然界中发现的大多数转氨酶对s立体化学具有选择性，试图通过基因工程合成有用的r选择性ω-转氨酶的努力只取得了有限的成功
奥地利格拉茨大学的一个研究小组一直在寻找进一步的r选择性转氨酶，以添加到市场上可获得的一种转氨酶中节细菌属．2他们从三个野生型r选择性Ω-transaminases开始，其中很少有关于立体选择性或底物范围的数据，从它们中分离出来生丝单胞菌属镎，曲霉属真菌terreus而且节细菌属sp．测试反应涉及使用d -丙氨酸作为胺供体的前手性酮的胺化，但所形成的丙酮酸必须通过第二酶促过程从反应混合物中去除，要么通过使用丙氨酸脱氢酶进行酮还原，要么通过丙氨酸脱氢酶介导的还原胺化。
一系列的前手性酮底物进行了测试。的节细菌属除了a-四酮外，所有测试的酶都有效，在每种情况下，所需的胺作为ee超过99%的r对映体。酶来自曲霉属真菌terreus转换了三个测试基板。
与此同时，从之前的市售酶开始，经过11轮突变后，一种接受大体积酮的转氨酶被开发出来。然而，这并不适用于丙氨酸作为胺供体。通过使用大量过量的2-丙胺代替，反应是成功的，同时产生了丙酮作为副产物。对于所有这四种新酶，可以添加DMSO作为助溶剂来提高底物的溶解度，在某些情况下，比不添加DMSO可以获得更好的转化。
英国桑威奇的辉瑞公司实验室就是一个很好的例子，展示了如何利用生物催化来改善生产过程。3.最初合成的一种用于治疗过度活动膀胱的有效β-3激动剂涉及诺依里不对称降低，仅给予77%的适度ee;这意味着需要制备反相手性高效液相色谱来纯化该反应中生成的氯丙烷，因此，总收率仅为46%。其他各种还原条件，如均相不对称氢化和DIP-Cl不对称还原也没有得到更好的证明。
第二个问题是锡化学中使用的醇中间体的合成问题，从处理、清洁和废物处理的角度来看，这远非理想。
为了解决这些问题，研究人员用酮还原酶催化的不对称酮还原取代了Noyori还原，并使用了脂肪酶催化的去对称路线而不是锡化学。首先，筛选260个酮还原酶。来自于利希的一种酶看起来很有前景，但在放大后，反应停止在60%的转化率。接下来的尝试涉及Codexis公司的KRED-130。虽然在屏幕上的转换更好，但它产生的ee不是那么好。然而，当在1g的规模上尝试时，5小时内就可以看到完全转化，r -氯丙烷产品的分离收率为97%，ee为95%，这比他们预期的要好得多。最后，他们尝试了自己的醛还原酶突变体掷孢酵母属salmonicolor，同样在1g的规模，给予85%的收率产品97% ee。
在锡置换反应中，他们选择了一种商业上可以买到的丁腈，这种丁腈很容易水解成二酸，然后在同一个罐子里酯化成二乙酯，然后去对称成单酯，然后再精制成所需的醇中间体。文献中有关于去对称性的先例，但它涉及到140°C的盐酸，而生物催化过程将更温和，更环保。这一次，他们发现了15种市售的水解酶，可以选择性地将二酯水解成单酯，其中一些还能产生少量的二酸。
第一个“热门”是Meito脂肪酶MY from假丝酵母茶树菇，并在准备量表上进行了测试。尽管21小时后，高效液相色谱显示94%转化为单酸，但只有49%可以分离出来，他们认为“缺失”的产物可能留在了生物催化剂的残留物中。另一种很有前途的酶，诺维信公司的Lipozyme TL 100L，它是一种Thermomyces lanuginosus尝试了脂肪酶，这一次有可能避免在检查过程中产品夹带。将其放大到200g，单酸的分离率为94%。由于没有色谱分离或高毒性试剂，这一路线是对原来的锡介导工艺的重大改进。
诺维信销售各种用途的酶，包括生物制药
图片由诺维信提供
有时，酶解仍然是制备手性中间体的唯一合理方法，也许是因为没有明显的起点来开发一种酶以对映选择性的方式进行反应。在这些情况下，最好的策略是使用动态动力学分辨率，其中“错误的”对映体被回收，并优化酶的性质，使产量最大化，同时给予具有极好的ee的产品。这是美国新泽西州默克公司工艺研究部门的一个小组采用的策略。
组织蛋白酶K抑制剂odancatib的合成，正在开发治疗骨质疏松症，涉及到一个生物催化动态动力学分解，以获得手性氟磺酸中间体。4最初，他们使用固定化的CAL-B脂肪酶Novozym 435，但尽管它具有合理的活性，但其稳定性不足以促进商业上可行的工艺，而且其他商业上可用的固定化CAL-B酶在其工艺条件下也不够好。
有时，酶解仍然是制备手性中间体的唯一合理方法，也许是因为没有明显的起点来开发一种酶以对映选择性的方式进行反应
因此，他们希望创造出自己的固定化CAL-B，在他们的系统中工作得更好。研究的起点是三菱公司的五种不同的Sepabead树脂，它们具有多种不同的成分和官能团，允许共价和疏水固定结合技术。他们将诺维信的CAL-B液体与每种树脂在室温下孵育24小时，然后过滤掉树脂，用缓冲液清洗，然后在真空下干燥。
然后对五种树脂中的每一种进行了活性测试，用聚甲基丙烯酸酯树脂ex -120疏水结合固定化酶得到了最佳结果。与Novozym 435相比，其比活性提高50%。此外，48小时后，商业酶的活性下降到其初始值的6%在工艺条件下。相比之下，ex -120固定化酶在这段时间后仍保持94%的活性。在连续填料床塞流反应器中，其稳定性显著提高，产率和ee分别为95%和88%，高于90%和86%。由于它更稳定，酶与底物的负载可以从商业酶的1:20降低到1:100以下。
他们还研究了替代底物，对于他们尝试的七种芳香仲醇和胺，在18小时的实验后，获得了超过99%的ee。此外，树脂在该过程中失活后可以用进一步的酶重新充电，进一步降低了成本。
除了将酶固定在珠子上，还可以通过封装来固定它们。例如，仿生二氧化硅矿化可用于将它们困在二氧化硅支架中。法国图卢兹大学的一个研究小组将酶包裹在二氧化硅颗粒中，从而改变了酶的活性和对映选择性。5他们取了两种酶荧光假单胞菌酯酶I (PFE-I)和CAL-B脂肪酶-并将它们直接与硅沉淀R5肽融合Cylindrotheca梭杆菌属，促进二氧化硅凝结。起初，他们尝试将这种肽与聚阳离子聚合物聚乙烯亚胺一起催化二氧化硅沉积，但包封率低于20%，大部分酶蛋白仍留在溶液中。相反，他们在R5肽和他们想要固定的蛋白质之间创造了一种重组融合蛋白，表达来自大肠杆菌的PFE-I和来自产油酵母的CAL-BYarrowia lipolytica．
然后将纯化的重组蛋白与硅酸盐前体四甲基-正硅酸盐混合，在盐酸中水解。所得到的二氧化硅沉淀物通过离心分离，然后用水冲洗并冷冻干燥。他们通过检查剩余的上清液发现，在这两种情况下，超过95%的蛋白质被固定在二氧化硅颗粒中。
然后他们观察了被包裹的酶在进行对映选择性过程中的效率。实验反应为外消旋型3-苯基丁酸(一种常见的手性合成物)与乙醇的酯化反应。他们惊讶地发现，尽管CAL-B-R5在之前的测试反应中有活性，但没有与CAL-B-R5转化。然而，与游离酶相比，PFE-I-R5不仅具有更好的转化率和更高的对映选择性，而且还具有相反的对映体。他们认为这是第一次报道这种封装后的反转，他们假设二氧化硅基质促进了构象的包裹，从而给自由酶提供相反的对映体。
流动反应器正越来越多地应用于化学合成，因为它们在改善混合和降低放热反应爆炸风险等领域具有优势。然而，由于反应混合物的非均质浆液性质以及气体和液体处理的问题，他们发现在生物催化领域的应用要少得多。
流动反应器在生物催化中的应用较少，因为反应混合物的非均质浆液性质以及气体和液体处理的问题所带来的挑战
生物反应的停留时间通常需要更长的时间，而且该过程的多相性质使得使用传统的管状反应器非常棘手。为了解决这个问题，由英国技术战略委员会共同资助的生物化学家项目的一个团队一直在寻求开发生物催化反应的连续制造方法。6该项目的合作伙伴是Ingenza、CTech Innovation和AM Technology。
大多数大型流动反应器都有两种设计之一——要么采用静态混合，要么采用动态混合。采用静态混合的反应器依赖于反应器管一侧的湍流或挡板;这些通常是狭窄的，因此在非均相生物催化反应中，有反应器堵塞、相分离或混合不佳的趋势。另一种动态混合反应器使用机械搅拌器，提供高效的混合，不依赖于通过反应器的流动性质。该团队使用了Coflore搅拌管式反应器，该反应器具有松散的反应器元件，结合振动来进行混合，这也克服了传统的管内旋转混合器遇到的一些问题。
试验反应为外消旋氨基酸的动态动力学拆分。在外消旋体中d -氨基酸的选择性氧化得到l -氨基酸和α-酮酸的混合物，氧化的催化剂是由表达的氧化酶毕赤酵母属pastoris，黄素腺嘌呤二核苷酸作为氧化还原辅因子。氧气也需要作为一种共底物，并通过一个充满气体的入口被引入反应器。
只要反应混合物中有足够的酶，良好反应速率的主要障碍是氧气的存在，因此高效的混合很重要
只要反应混合物中有足够的酶，良好反应速率的主要障碍是氧气的存在，因此高效的混合很重要。事实上，随着搅拌器在批处理容器中的速度增加，反应速率增加。然而，随着批量的扩大，反应速率下降，有限的酶寿命意味着有一个显著的生产力下降。
在Coflore反应器中，1升规模的反应比在1升间歇反应器中进行的反应速率高3倍。当放大到10L时，反应速率基本保持不变——改变管的长度对混合和气体分布的影响很小，与间歇反应器相比，这些参数随着容器尺寸的增加而发生巨大变化。重要的是，固体物质，如有机物质和死细胞，可以堵塞静态混合流反应器的狭窄管道，没有造成任何问题，并且没有看到堵塞问题，研究小组将其归因于Coflore反应器内的高混合效率和大管道直径。
参考文献
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