2018年6月，在缬沙坦的活性药物成分(API)中发现n -亚硝基二甲胺(NDMA)，导致卫生当局和制药行业开展了前所未有的活动，以了解根本原因并减轻药品中这些潜在致癌杂质的存在1、2
赛默飞世尔制药服务公司实验室系统和技术总监Tanya Tadey报告说，从那时起，已确定的n -亚硝胺杂质和受影响产品的清单不断增加，导致了召回，在雷尼提丁的情况下，从市场上撤出。3.
欧洲药品管理局(EMA)和其他监管机构已作出回应，要求上市许可持有人(mah)评估和解决其产品中n -亚硝胺杂质的风险。4、5
在开发和验证药品中检测亚硝胺的分析方法时，这些要求向公司提出了新的复杂挑战。
许多制药公司、生产机构和合同检测实验室正在寻找最合适的仪器，以支持监管机构要求的风险评估和常规检测。
这些仪器应具有足够的灵敏度和选择性，以明确检测监管当局规定的水平的亚硝胺。例如，美国食品和药物管理局(FDA)建议，日剂量高达1克的产品应采用定量限制(LOQ)为或低于30 ppb的方法。
对于高剂量(> 1g)产品或预期存在多种亚硝胺时，可能需要更高的敏感性。质谱(MS)和色谱法是n -亚硝胺分析的关键技术，因为它们提供了支持不同分析阶段所需的灵敏度和分辨率。
然而，对于实验室来说，选择最合适的仪器可能具有挑战性，因为亚硝胺分析没有一刀切的方法，需要考虑许多因素。
对于药品检测机构来说，亚硝胺问题已经产生了许多与业务和技术相关的挑战。
在决定如何在技术和操作层面上向前发展之前，公司必须深入了解新的需求及其对测试的影响。EMA和FDA认识到行业面临的挑战，作为回应，举行了网络研讨会和问答会议。尽管有这些支持，问题依然存在。
监管机构要求实验室在存在亚硝胺杂质风险时，使用经过验证的方法对原料药和药品进行验证性检测。
尽管实验室可以自由选择他们使用的仪器以确保达到合规性，但许多实验室不确定在不同类型的分析中选择哪种仪器。此外，实验室必须根据自己的优先级(如稳健性或吞吐量)来权衡他们的选择。
制药公司在实施工具和开发流程以确保合规方面承受着巨大的压力。在现有产品中检测到n -亚硝胺将最终导致更安全的药物;然而，几乎没有犯错的余地。
由于n -亚硝胺分析结果不准确，因此结果的一致性至关重要。假阳性结果可能导致产品召回造成不必要的经济损失，以及花费在调查和可能的重新配制上的时间。
相比之下，假阴性结果的产生意味着这些潜在的致癌化合物仍然存在，并且在药品中未被检测到。
在制定和验证亚硝胺分析方法时，仔细考虑产品基质、化学成分和潜在的干扰或污染源有助于避免错误的结果。例如，如果亚硝胺前体、亚硝酸盐和二胺或叔胺一起存在于样品基质中，则亚硝胺可能在样品制备过程中形成。6
当这些成分在样品制备过程中存在时，即使是在低水平，也应避免已知的加速亚硝胺形成的条件，如酸性pH值和热。
一个被广泛引用的例子是在顶空气相色谱(GC)分析雷尼替丁产品时形成的NDMA。
此外，在样品制备和处理过程中使用的许多塑料和橡胶材料可能含有微量亚硝胺。通过了解亚硝胺产生的化学成分和潜在来源，分析人员可以更好地调整他们的方法，以避免错误的结果。
除了检测亚硝胺杂质外，实验室还可以考虑筛选药品和前体化学物质的成分，例如可能有助于形成亚硝胺的亚硝酸盐和胺。
通过定期监测前体，实验室可以掌握数据，帮助确定和控制亚硝胺的潜在形成源。例如，如果亚硝胺出现在下游的药品中，实验室可以检查辅料中的亚硝酸盐水平，以确定任何相关性。
在选择亚硝胺分析的特定仪器和技术时，实验室将寻求不同来源的指导，例如监管机构公布的详细说明特定药品中亚硝胺测定的方法。7
对于许多人来说，这些已发表的方法可以作为开发和验证亚硝胺分析方法的起点。然而，即使在这些情况下，方法也必须在内部进行验证，以证明对所测试的特定药品的适用性。
迄今为止，已经发表了使用各种平台的方法，如LC-MS/MS, GC-MS和LC/高分辨率MS (HRMS)。这些技术中的每一种都有其优势，具体取决于所测试的亚硝胺和产品。因此，在选择测试技术时，应该考虑测试的应用程序和类型(筛选测试和释放测试)。
两种常用的亚硝胺检测系统是HRMS和三重四极杆质谱(QqQ-MS)。拥有高分辨率质谱仪尤其有利于初步筛选分析，以确定可能没有标准的新亚硝胺。
它也是具有复杂基质的样品的首选，因为高分辨率可以选择性地检测感兴趣的亚硝胺-即使存在腔洗脱干扰。相比之下，QqQ-MS由于其坚固耐用和易于使用，可能是质量控制环境中高通量分析的首选技术。
然而，与不太依赖色谱分离的高分辨率质谱相比，改进低分辨率QqQ工作流程的色谱方法可能需要更多的时间和资源。
在分析之前，HRMS和QqQ-MS都需要GC或液相色谱(LC)来分离样品成分。这些高度正交的技术可以应用于初始开发和筛选，以确保亚硝胺能在药品基质中准确定量。
图1雷尼替丁片剂样品的质谱显示NDMA和DMF分离;当使用不适当的质量公差设置进行数据处理时，DMF会导致NDMA的高估
与LC系统相比，气相色谱系统通常具有良好的灵敏度和色谱分离水平;然而，这确实需要特殊的考虑。
气相色谱顶空采样过程中产生的热量有可能在原位产生亚硝胺，因此必须谨慎使用。气相色谱分析还要求分析物具有挥发性，但足够稳定。
然而，对n -亚硝基二苯胺实现这一目标只能通过耗时的衍生化步骤实现。8理想情况下，尤其是在以简单为目标的高通量、质量控制环境中，衍生化将被避免。衍生化延长了工作流程时间，对于低丰度杂质(如亚硝胺)更复杂。
当考虑两种紧密洗脱化合物，如NDMA和残余溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)时，充分的质量分辨率的重要性得到了证明(图1)。
一般来说，如果这些化合物不能被高性能LC分解，那么用QqQ很可能无法实现足够的质量分辨率来区分两者。
FDA在2020年发表的一篇论文中强调了这一潜在的陷阱，其中一家私人测试实验室高估了二甲双胍中NDMA的水平。8
所使用的分析技术是高分辨率飞行时间质谱;然而，由于分辨率不够，DMF干扰了NDMA的测量。假阳性导致了昂贵的产品召回，如果使用分辨率更高的质谱仪，本可以避免这种情况。
许多实验室不是选择一种MS仪器进行亚硝胺分析，而是选择同时使用QqQ和高分辨率MS仪器来支持亚硝胺检测的复杂要求。
高分辨率质谱仪因其高分辨率和选择性而具有吸引力，通常比QqQ仪器提供更多的分子和结构信息。在方法开发和初步筛选研究期间，或在复杂基质存在时，这可能特别有益。
另外，QqQ还可以提供一定程度的敏感性和定量准确性，非常适合进行有针对性的分析。此外，QqQ仪器是高度健壮的，这在常规测试环境中特别有价值。
EMA和其他监管机构对药品中亚硝胺的检测做出了回应，对药品制造商提出了新的要求。
面对这些测试要求，实验室现在必须决定他们将如何实施分析工作流程以确保合规。正如以往关于高估甚至假阳性结果的报告所证明的那样，需要稳健、灵敏和准确的仪器来支持药品中亚硝胺的分析。8
通过仔细考虑样品类型、实验室优先级和分析类型，实验室可以找到最适合其需求的色谱和质谱技术。无论选择何种仪器，高水平的产品和化学理解对于开发和验证准确和可靠的方法是必不可少的。
鉴于亚硝胺分析的复杂性和高风险性质，实验室可以从与供应商讨论其选择中受益，供应商可以就如何采取步骤建立支持亚硝胺分析的工作流程及其实验室未来几年的需求提供建议。
参考文献
