基因疗法作为一种治疗人类遗传性疾病的方法具有巨大的潜力。这种新兴的治疗方法可以纠正或取代病理突变，使功能不正常的突变基因失活，还可以引入新的基因来帮助我们的身体对抗疾病。赛默飞世尔科技公司的迈克·布鲁尔和亚历杭德罗·贝塞拉报道
驱动基因治疗效果的一个关键拐点是将治疗基因运送到目标细胞。在过去的几十年里，基因传递载体技术取得了重大进展，特别是在安全性和合规性的治疗性基因转移载体设计方面。
腺相关病毒(Adeno-associated viruses, AAV)由于其对人类无致病性，能够感染广泛的细胞和整体安全性，已成为用于基因治疗的最重要的病毒载体传递工具之一。
细胞和基因治疗领域正在迅速发展，美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)的代表都预测，到2025年，每年将有10-20种细胞和基因疗法获得批准。1
目前有两种fda批准的基于aav的基因疗法，一种是2017年批准用于治疗罕见遗传性视网膜营养不良的Luxturna (Spark Therapeutics)，另一种是2019年批准用于治疗脊髓性肌萎缩的Zolgensma (Novartis)。随着该领域的不断扩大，围绕AAV制造和治疗效果的持续创新将成为开发和批准更多基于AAV的基因疗法的关键驱动因素。
迄今为止，大多数基因治疗应用都针对罕见疾病;然而，已获批准的疗法以及临床准备中的疗法所取得的成功，已将其应用扩大到更大的患者群体和更多的疾病，包括血友病和神经性眼病。
治疗更大的患者群体将需要基础设施和技术，以扩大AAV生产，以满足未来的需求。
制造符合临床要求的AAV载体的关键障碍包括高成本、可扩展性和由于漫长的生产过程而延长的制造前置时间。
AAV载体生产过程的优化仍然是创新的关键重点领域，不仅可以提高制造过程的生产效率，还可以降低成本。
反过来，这种效率将降低最终基因治疗产品的总体成本，推动患者获得这些突破性治疗。这种优化的一个关键部分是制造过程的可伸缩性。
标准化和可重复性是缩放过程的关键。在上游病毒生产步骤中，病毒包装质粒和感兴趣的基因被递送到宿主生产细胞系中。
哺乳动物和昆虫细胞系通常被用作病毒生产的平台。在昆虫细胞的情况下，未定义的细胞培养基成分，如酵母酸盐，可以使其难以实现性能的可重复性。
在哺乳动物细胞培养中，最佳培养条件通常包括添加血清或添加剂，当首选(或目标)无动物源过程时，这些条件并不理想。
在临床载体制造的规范空间内，科学家们越来越多地转向化学定义的介质和蛋白质表达增强子的完整系统，从早期发现到大规模生产。这些完整的生产解决方案通常比标准协议更快，并且设计为可扩展的。
直到最近，下游净化过程还依赖于学术界使用的工具，而基因疗法的大部分研究和发现都发生在学术界。这些工具可能适合于小规模的学术工作，但不适用于商业制造。
AAV下游净化的解决方案正变得越来越可扩展，使制造商能够克服与AAV净化相关的关键挑战，包括与上游工艺的高度变化，由于细胞裂解而增加的杂质负担和不同的澄清策略。
开发人员已经转向亲和色谱作为AAV下游处理的第一个澄清后步骤。最新的亲和树脂可以适应广泛的上游工艺和AAV血清型，同时允许开发人员平衡工艺设计，以简化可扩展性，提高生产力，并通过“平台性”实现简化。
由于AAV生产的性质，宿主细胞杂质进入下游纯化的负担高于单克隆抗体或重组蛋白。
开发人员应考虑尽早实施亲和层析，以便在达到后期层析步骤(如离子交换)之前，在早期阶段去除包括宿主细胞蛋白质和DNA在内的工艺杂质。
高纯度和高产量可以在一个步骤中实现。亲和层析还可以浓缩AAV产品，而不需要对进入色谱柱的负载材料进行重大调整。
最终，流程开发只能在分析允许的情况下有效。质量控制测试，包括支原体和残留宿主细胞DNA测试，可以帮助开发人员利用分析洞察力来简化他们的流程，同时证明他们的产品符合监管标准。
监管机构呼吁支原体在细胞培养中污染物最容易被检测到的特定时间点进行测试。对于AAV制造，建议支原体在细胞培养过程结束时、在生物反应器收获时以及在重组AAV纯化之前进行测试。
而不是依靠延长时间或28天培养为基础的测试支原体在美国，开发人员可以使用快速检测(如PCR)。2
基于实时PCR的检测也为残留宿主细胞和载体DNA提供了一种准确、灵敏的检测方法。这应该在整个纯化过程中进行，以了解在该过程的每一步清除宿主细胞和相关载体DNA成分的能力。
基于AAV载体的产品的最终剂型必须符合或超过主要区域和全球监管机构(包括FDA、EMA和世界卫生组织)以及当地监管管辖区制定的指导方针。
FDA的监管指南指出，使用连续非致瘤性细胞的过程中，最终产品中残留的宿主细胞DNA水平每治疗剂量应小于10纳克。
当残留DNA水平接近规定的极限时，DNA大小应小于200个碱基对。3.
目前了解到AAV可以从重组AAV过程中使用的载体中包装宿主细胞DNA和/或DNA片段。为了充分了解该成分，制造商可能会寻求新兴的分析技术，例如使用下一代测序(NGS)来表征和识别在纯化结束时存在于产品中的残留DNA。
通过完成纯化病毒的全基因组分析，该技术可以提供更完整的AAV基因组DNA和最终产品中可能存在的残留宿主细胞或载体DNA的图像。
这种应用才刚刚开始探索，但随着实验室采用这种技术，监管期望不断提高，需要更详细的文档，这种应用可能会变得更加常规。
随着预计越来越多的基于AAV的疗法进入临床管道，开发人员将需要考虑如何最好地优化其制造工艺，以满足对大容量、高滴度AAV载体制剂的需求，以及后续大规模下游工作流程步骤的处理，同时保持安全和质量标准，以满足监管要求。
为了实现这一目标，该领域的创新需要专注于推动上游和下游制造流程可伸缩性的工具。
端到端的病毒生产工作流可以从小规模的早期发现无缝过渡到大规模的商业制造，这将使AAV生产的可扩展性达到新的高度。
参考文献
