LC/MS峰识别:自动化与分析

10月10 - - 2019

高压液相色谱/质谱(LC/MS)是一种有助于正确、准确地鉴定药品和中间体中杂质的重要技术

随着自动化的不断改进，分析的许多方面现在可以在没有分析师大量输入的情况下完成;然而，Cambrex分析研究与发展副总监Karen Spillman报告说，这并不意味着人工输入是多余的，因为有许多技能是计算机无法复制的

当决定使用LC/MS时，可能不像准备样品进行分析，然后在仪器上选择最灵敏的质荷比那么简单。感兴趣的质量通常只能通过提取每个质荷比来识别，以将质量与基线、光谱中较大的峰值或溶蚀杂质区分开。

可以对质谱仪(MS)进行能量、热量、流量、极性甚至源的变化，以确保实现准确的分析。自动化是LC/MS分析的重要工具;然而，目前它还不能进行产生可靠结果所需的严格审查。

本文将研究自动化所扮演的角色，并突出分析人员仍然必不可少的例子。为了本文的目的，假设HPLC条件是ms兼容的，并且可以保持不变进行分析。

自动化已被证明在样品制备中有好处，仪器已被证明能够准确地改变样品浓度，甚至称重和稀释样品。样品制备在LC/MS分析过程中至关重要，以确保能正确检测出感兴趣的杂质。

如果在分析方法中与其他杂质和主峰分离良好，则可以增加样品浓度或进样量以产生更好的响应。

然而，如果柱上浓度增加，样品也应在名义浓度下进行分析，因为使用两种浓度有助于通过消除在具有相同响应的两种注射中看到的质量来确定峰值，并关注基于浓度变化的质量。

当在LC/MS上建立分析时，自动化可以按照建议协助所有这些步骤

• 始终使用符合MS的紫外线检测器:在大多数情况下，分析人员将使用已知感兴趣杂质位置的现有HPLC-UV方法。使UV与MS保持一致，可以使分析人员看到HPLC-UV所查看的剖面，并且可以更容易地识别感兴趣的峰值。即使感兴趣的杂质没有发色团，也不会使用紫外检测器可见，重要的是使用该检测器来消除基线中的假峰。
• 运行一个空白稀释剂:空白将有助于建立MS分析的背景，显示感兴趣的质量与背景噪声之间的差异。大多数软件系统可以减去这个背景以便于分析。
• 每种样品制备至少注射两次:质量电荷比可以归因于一个兴趣峰值将持续出现。如果质量电荷只出现在一个样品的一次注射中，这不是适当的识别证据。有可能有一个质量电荷比，适用于不是在每个样品中都存在的感兴趣的峰值，但这应该只发生在低MS响应的峰值，质量应该出现在大多数样品中，以确保正确的识别。
• 电喷雾电离(ESI)模式开始分析:大多数化合物可被ESI检测到;而且，尽管一些系统需要手动改变探测器类型，但其他仪器有一个多模源，可以通过软件切换。
• 用正负模式分析样本:对于杂质检测，不建议使用双模式，因为这会进一步分割能量并降低ms的检测能力。理想情况下，分析人员应该在一种模式下对整个序列进行编程，然后切换到另一种模式并重新分析序列。
• 将扫描范围设置为感兴趣峰值的估计质量的四分之一到两倍:例如，对于质量为400的理论化合物，范围将设置为100-1000 m/z。如果主峰为400，则可以将范围设置得更高，以便对质谱分析过程中可能形成的降解物和二聚体进行全面检查。如果要使用一个库，则可能需要将质量设置为30-50，以便软件更好地识别。
• 为实验室设置一些“典型”的质谱参数，以供识别:始终使用相同的起点，以确保不会因为过程中的更改而错过识别，这是一个好主意。如果在第一次分析后无法找到感兴趣峰值的质量，则可以更改参数。

在仔细检查数据后，如果无法提取出感兴趣的峰值，则应改变质谱条件，以确定能量、温度或检测类型的变化是否允许发现峰值。

有时，可能需要使用配备了大气压化学电离(APCI)的探测器，这种探测器产生的碎片比ESI少，但需要对源参数进行更多的微调才能获得可接受的结果。

软件系统能够生成质荷比，并与编程库进行比较，但如果化合物未知或扫描范围不够，则识别将不正确或不可能。

为了克服这一问题，可以使用软件从提议的结构中估计相关化合物，但这在很大程度上依赖于一个或多个结构的分析人员的输入，并且无法了解生产材料的过程并获得所有与过程相关的化合物。对于大多数峰的识别，分析人员仍然需要对感兴趣的峰的洗脱顺序、反应和质量做出明智的决定。

一旦HPLC分析完成，必须仔细检查色谱图，以确保做出积极的鉴定。理想的峰识别应在UV和MS色谱图中显示一个分离良好的峰，以及一个较大的质荷比峰，如图1所示，其中峰1的识别确定为ESI负模式下的635.5 m/z。

这种类型的识别可以自动完成，以识别出最佳响应峰作为感兴趣的峰。然而，大多数峰的识别并不是那么简单。图2、图3和图4显示了三个不同的实例片段，其中的峰值被识别出来，每个实例片段都突出了在批量识别过程中可能遇到的不同挑战。

图2显示了在465.4 m/z和467.4 m/z处的大响应，这两者都与邻近的峰有关，而不是感兴趣的杂质。第三大峰391.3 m/z可能是鉴定样例a的候选峰。391.3 m/z的提取证实了这个质电荷比适合鉴定样例a，因为在色谱图中没有看到其他具有此质量的显著峰(如图5所示)。

也许可以对软件进行编程，使其忽略与相邻峰相关的峰，但如果相邻峰不是主要的或先前确定的成分，并且两个峰都能提供良好的提取色谱图，那么就会变得更加困难。

感兴趣的峰值在MS上也可能给出非常差的响应，在图3中，在100-980 m/z范围内可以看到一些峰值，但分析人员对这些碎片的提取进行检查后发现，所有的质量都与邻近的峰值或基线有关。对图3的基线进行了检查，发现在317.1 m/z处有一个非常小的峰值，这在其他注射剂和样品中是可重现的，并且是所感兴趣的峰值所独有的。

然而，317.1 m/z处的峰值确实存在挑战，因为萃取的响应较低(如图6所示)，这导致在六次注入中有一次没有检测到峰值。为了进行完整的鉴定，必须对杂质的结构进行理论化，获得和注入杂质。在这种情况下，软件不可能在这种碎片中识别这个低响应峰值。

图4显示了一个完整标识的好例子。在343.4 m/z的萃取温度下鉴定出了该峰，该峰为工艺预期杂质。按照样品标称浓度的方法制备杂质，以标称浓度的1%加标成3个样品。

然后对加标样品、杂质样品和非加标样品进行分析，使用与343.4 m/z提取相同的MS条件。这种样品组合允许通过UV和MS分析质量和保留时间，以肯定地确认杂质的鉴定。

进一步的考虑

虽然质谱可以产生理论质量，但只有通过对质量鉴定过程中获得的峰值和从外部来源收集的杂质进行比较研究，才能确认杂质的身份。

在大规模鉴定过程中可能会遇到其他挑战，包括在感兴趣的保留时间，在质谱色谱中没有可见的峰。在这种情况下，仍然应该产生碎片并进行提取，因为质谱可能显示所需的质量而没有可见的峰值。

来自邻近峰的干扰是最常见的问题之一，当一个大的主峰靠近感兴趣的杂质时尤其普遍。在这种情况下，分析人员必须仔细检查质谱扫描期间获得的所有质量，并记住，作为接近的洗脱峰，质量可能没有太大差异，甚至可能具有相同质量的手性。

可能需要获得馏分来完全分离杂质和干扰，如果合适，可以使用飞行时间(TOF)质谱仪，它可以提供更精确的质量和更精确的分离紧密洗脱峰。

LC/MS的质量鉴定面临许多挑战，这些挑战可以通过仔细调整质谱仪参数和检查生成的数据来克服。从一个重复的样本中产生的数据量——在阳性和阴性模式下分析——是重要的，应该仔细检查，以确保阳性识别。

虽然自动化可以帮助改变仪器、样品制备和产生质电荷比，但它需要经验丰富的分析师根据化学过程、相关化合物和色谱条件的知识确定质量，并通过spike研究确认识别。

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• Cambrex