当涉及到测量CAR-T细胞的细胞毒性时，并不是所有的细胞活力分析都是一样的，Axion生物系统公司的应用总监丹尼尔·米勒德说
过继细胞疗法已经打破了癌症治疗的新界限，但研究人员和制造商还有很长的路要走。这些疗法只被批准用于治疗大约20种癌症，对治疗表现出持久反应的患者比例不到五分之一。1、2
此外，过继细胞疗法会产生使人衰弱甚至致命的副作用。3，4随着科学家们致力于开发更安全、更有效的免疫疗法，细胞活力测定对于准确地描述体外细胞相互作用并确保基于细胞的产品的一致性至关重要。
过继细胞疗法的制造过程很复杂，涉及各种生物学、后勤和患者安全方面的考虑。制造安全有效的过继细胞疗法的关键是以体外癌细胞为模型测试它们。
研究人员有一些常规方法可以用来测试细胞活力;但是，随着细胞疗法发展的成熟，一些人寻求更复杂、更安全、更容易使用的技术，直接告诉科学家一种疗法的细胞毒性。以下是测量细胞活力的五种方法，展示了与测量过继细胞疗法质量相关的挑战和机遇。
铬释放测定:自1968年以来，科学家们使用铬释放试验来研究各种化合物的细胞毒性和其他因素。它仍然是一种被广泛接受的方法来衡量过继细胞疗法的效力。
检测方法很简单:研究人员将铬的放射性同位素插入目标(肿瘤)细胞，然后应用活性CAR-T或CAR-NK细胞。当目标细胞死亡时，它们会泄漏辐射。在若干小时后，研究人员测量样品发出的辐射量。辐射信号的强度表明了细胞死亡的程度。
许多研究人员依赖于铬释放测定;然而，有些人寻求一种限制更少的新方法，如终点测定。这些仅测量相互作用结束时的细胞死亡，对过继细胞治疗动力学的细微差别视而不见。
这种限制阻止用户评估诸如峰值杀伤率，以及慢性激活和t细胞衰竭的迹象等指标。此外，该测试使用有毒辐射作为指标。幸运的是，在过去的几十年里，研究人员已经找到了更安全的方法来测量细胞活力。
MTT检测用无毒指示剂——四唑盐MTT测量细胞死亡。线粒体含有一种将MTT转化为紫色晶体的酶。一旦细胞死亡，这种反应就会停止。使用分光光度计，研究人员可以量化紫色的浓度，这代表了细胞死亡的程度——紫色越浅，样本中死亡细胞的比例越高。
MTT测定方法廉价且易于执行。而且，由于它们不释放有害辐射，所以是安全的。但它们与铬释放测定法有一个重要的限制:MTT测定法也是终点测定法。因此，研究人员无法测量细胞毒性的动力学。
LDH化验:所有细胞都会产生乳酸脱氢酶(LDH)，当细胞膜受损时，这种酶就会泄漏出来。因此，LDH可以作为培养皿中细胞死亡的指标。但是研究人员不能直接测量乳酸脱氢酶，这使得检测更加复杂。
首先，乳酸脱氢酶将乳酸转化为丙酮酸。当丙酮酸与细胞外溶液中的四唑盐相互作用时，它形成一个水溶性的红色分子。然后研究人员用比色法量化红色的强度;红色越强烈，治疗效果越强。与前两个例子一样，乳酸脱氢酶测定也是终点测定。然而，新一代的细胞活力分析已经解决了这个问题。
Live-cell成像是一种光学技术，科学家可以用来可视化过继细胞治疗活动。与上面提到的所有方法不同，活细胞成像使研究人员能够实时测量细胞死亡。研究人员可以连续测量数小时到数周的细胞杀伤情况，并在整个实验过程中检测关键事件。
虽然活细胞成像克服了传统细胞活力分析的主要限制之一，但这项技术引入了新的挑战。为了进行活细胞成像实验，用户在添加一层工程免疫细胞之前，将肿瘤细胞放在平板上，并观察它们相互作用。
工程细胞可能会挡住肿瘤细胞的视线，使得肿瘤细胞死亡时很难被发现。一些科学家使用染料来区分两种细胞类型，以克服这一限制，但这种额外的操作威胁到研究的可靠性和有效性。此外，这种方法产生的可视化数据，研究人员必须进行主观分析，从而在结果中产生不确定性。
生物电子阻抗监测:工程师们建立了生物电子分析，以克服早期细胞活力分析的一些限制。这些分析使科学家能够实时无创地检测细胞死亡，而无需使用显微镜或任何探针或染料。因此，这些检测方法可以连续监测复杂的细胞相互作用，而不受化学物质的干扰，持续数小时至数周。
生物电子分析在多孔板中进行，每孔底部装有生物电子传感器。为了测试癌症治疗的效果，研究人员在平板上涂上一层肿瘤细胞，这些细胞附着在电极上。
接下来，研究人员添加了一层免疫细胞并监测相互作用。最初阻碍电极发出电信号的肿瘤细胞死亡。当这种情况发生时，它们分离，记录的阻抗下降。由于阻抗与细胞活力直接相关，研究人员可以观察到细胞死亡随时间的动力学。此外，研究人员可以使用多孔板一次测试和比较多个剂量。
佐治亚大学副教授Lohitash Karumbaiah博士使用生物电子实验来评估一种旨在杀死胶质母细胞瘤细胞的新型CAR-T细胞疗法的效力。5Karumbaiah博士发现，在7天内，他的CAR-T细胞杀死胶质母细胞瘤细胞的比例明显高于naive T细胞。
生物电子检测足够灵敏，可以测量低浓度CAR-T细胞条件下的细胞死亡。它还同时测量了多个CAR-T细胞浓度的影响。总的来说，生物电子检测使Karumbaiah博士获得了更多关于gd2靶向CAR-T细胞作为胶质母细胞瘤患者潜在治疗选择的见解。
测量细胞活力以评估免疫细胞效力
过继细胞疗法的效力是开发和制造过程中的一个关键衡量指标。研究人员需要准确了解一种治疗方法是否能达到预期效果，而制药商必须确保每批基于细胞的产品的一致性。
几十年来，研究人员一直在使用传统的细胞活力测定方法。尽管如此，随着过继细胞疗法变得越来越普遍，研究人员将受益于使用更复杂的分析，在开发过程的早期提供更多关于治疗的信息。
生物电子分析是最新一代的细胞活力分析。它们使研究人员能够实时评估过继细胞疗法的动力学，而无需使用可能干扰生物活性的染料、标签或探针。生物电子检测是生物制药制造商准确描述细胞相互作用并确保产品一致性的最佳选择。
参考文献
