截至2020年初，已有10种寡核苷酸药物获得美国FDA监管机构批准;随着更多的药物正在酝酿中，公平地说，这类药物正在成为一门大生意
治疗性寡核苷酸是一类基于DNA和RNA结构的药物，作用于基因和蛋白质的界面。通过选择性结合RNA等遗传物质，它们影响目标蛋白质的表达，从而产生有益的治疗效果。
基于天然积木的寡核苷酸，无论是基于DNA还是RNA，都能在细胞内被酶迅速分解。1这推动了对化学创新的需求，以修改和稳定这些结构，这些结构通常是由20-30个核苷酸残基组成的低聚物。
其中一些产物是单链的，而另一些是双链的。因此，这种结合天然和非天然残基的分子的合成在发现和开发过程中提出了许多挑战，特别是在扩大寡核苷酸合成时。
除了代谢稳定性外，将大而笨重的寡核苷酸输送到所需的作用位点也具有挑战性，需要进一步的化学修饰和标记策略。2本文讨论了酶的方法如何有助于更好和更便宜的方法合成寡核苷酸。
DNA或RNA由脱氧核糖或核糖糖单位组成，它们的特征碱基(A, C, G, T或U)由磷酸二酯键连接在一起。
传统的寡核苷酸合成使用磷酸酰胺化学，包括四个重复序列的反应(去保护、偶联、覆盖和氧化)，并依次添加单核苷酸(图1)。
图1:传统的寡核苷酸合成
这通常在固相模式中进行，其中寡核苷酸通过该循环从固体载体扩展。这种化学已经在许多方面进行了调整，以允许非自然单体单位被纳入寡核苷酸链。
已经采用了各种化学方法来提高稳定性和生物性能……图2显示了RNA衍生物的三个例子(尽管还有更多)。
其中一种方法是使用一种改良的磷酸二酯主链，在此过程中硫被引入以取代磷酸二酯键中的氧。
第二种方法为核糖环引入不同的化学功能，通常在2 '位置，甲氧基、甲氧基乙基和氟是最常用的基团。第三种方法是通过形成双环结构来“锁定”糖环构象。
所有这些都可以减缓寡核苷酸的代谢分解速率到有效治疗作用的可接受水平。
图2:修饰以促进寡核苷酸稳定性的例子
随着寡核苷酸接近市场推出，需要扩大和合成千公斤到吨数量的这些构建块，并以正确的顺序将它们连接在一起。
然而，大规模的寡核苷酸化学可能是有问题的。例如，对复杂色谱及其自动化硬件的需求可能会大大增加药品的这种活性成分的成本。
也许更糟糕的是，化学反应是线性的和连续的，随着链变长，产量呈几何级数下降。
例如，如果每个核苷酸连接磷酸酰胺循环的产率是95%，这对于四步循环来说是非常可观的，那么20 mer产品的总产率只有36%。杂质的形成和去除也经常是工艺中令人困惑的问题。因此，需要新的方法来研究这种化学反应。
近年来，生物催化技术使药物合成发生了重大变化。当酶被引入后，路线缩短了，成本降低了，过程通常“绿色”了，在许多情况下产生了惊人的结果。
Almac Sciences一直处于可持续合成革命的前沿，成功地利用分子生物学中发生的变革性变化，从而产生可以自信地设计出最大性能的低成本酶。3 - 5
目前已有强大的寡核苷酸合成技术基础，包括生产用于筛选的酶面板的能力，对生物转化发展的深刻理解，工艺优化和分子水平的生物催化剂工程。
基于这些基础，生物催化现在开始进入寡核苷酸合成的发展和概念在这里强调。
阻断物被宽泛地定义为具有4-8残基的非常短的单链寡核苷酸，它们是酶促合成较大寡核苷酸的基础。在这里说明的第一个例子中，RNA连接酶被用来形成一系列基于RNA的四个残基阻断物，通过将一个核苷酸添加到三聚体(指定ABC)。
Almac应用了最先进的合成生物学设计，通过创建不同的RNA选择酶连接酶面板，用于反应筛选。
图3中的反应是通过筛选selectAZyme RNA连接酶面板的残基X偶联(磷酸被保护在3 '和5 '阳性蛋白上)实现的，一些酶对给定底物表现出良好的活性。显而易见，获得酶筛选板对确定良好的活性至关重要，这是一个反复出现的主题。
图3:使用selectame连接酶将核苷添加到阻断剂中
图3还显示了selectAZyme碱性磷酸酶的使用，这种酶可以在3 '位置将磷酸基从反应产物上分离出来，为下一轮的合成和链延伸做好准备。
这也表明，筛选一组选择性磷酸酶可以为底物鉴定出良好的活性。一旦组装好所需的阻断剂，就可以开始建造更大的绞线。
酶通过将RNA阻断蛋白连接在一起来构建单链RNA的方法在20世纪70年代首次被描述出来。6、7
这种方法不依赖于模板来指导添加进来的底物，由酶的RNA连接酶家族催化(如上所述)，并根据天然和非天然基于核糖的核苷酸的组合将片段连接在一起。例如，图4显示了这个概念，其中两个非自然的片段(阻塞器)被连接在一起。
图4:使用selectAZyme连接酶的阻断物到阻断物组装(非模板法)
在本例中，两个核糖残基都在2 '位置上含有一个取代基(非自然等价基团)，并由硫代酯连接在一起;这两种策略结合起来稳定寡核苷酸防止降解。
为了成功开发这种技术，获得一组RNA连接酶进行筛选是至关重要的;一些酶不活跃，而另一些酶表现出良好的活性，如图4中的插入图所示(EVC为空载体对照;RB是反应缓冲液)。
Almac的酶工程方法包括使用其内部的INSIGHT平台，该平台允许从宏基因组中合理设计酶，而与传统定向进化相关的成本仅为一小部分。
在图5所示的反应中，这被应用于RNA连接酶，以改善在3 '和5 '位置(pX2Yp)保护的非天然核苷酸磷酸盐到三聚体ABC的添加。
图5:连接酶介导的ABC + pX2Yp偶联涉及RNAL 105酶突变
INSIGHT设计用于创建基于Almac selectAZyme酶RNAL 105的小而智能的工程RNA连接酶面板，RNAL 105围绕其活性位点进行了重新设计，以允许更好地与pX2Yp相互作用并改善ATP结合;这是驱动反应所必需的。
当筛选得到的酶面板时，与初始酶相比，活性增加了近10倍，显示了INSIGHT技术在RNA连接酶反应中的实用性。
参考文献
欲了解更多信息
吉尔·卡斯维尔，达伦·格雷，丹尼尔·f·a·r·杜拉多和史蒂夫·泰勒，阿伦化学公司，汤姆·穆迪，阿尔马克科学公司。
