截至2020年初，已有10种寡核苷酸药物获得美国FDA监管机构批准;随着更多的药物正在酝酿中，公平地说，这类药物正在成为一门大生意
一些寡核苷酸疗法是双链而不是单链(见第一部分)．虽然RNA连接酶可用于构建单链产物，但它也可用于双链合成(然而，创新者应该意识到现有的知识产权。8
为了产生双链寡核苷酸，可以组装一系列短的互补RNA序列(天然的、非天然的或混合的)。互补碱基配对允许片段组装成双工结构，然后RNA连接酶(或DNA连接酶)可用于将相邻的片段连接在一起。
图6说明了这种自组装(退火)和随后的连接化学的典型方法。RNA和DNA连接酶都可以从细菌和病毒源中筛选出来，产生几种具有良好活性的酶。
图6:连接酶自组装双链寡核苷酸的方法
Almac已经证明了酶配方在这些类型的反应中的重要性，以尽量减少背景反应和低聚物分解。细菌宿主和表达系统的明智选择可以防止背景宿主酶如核酸酶产生不必要的副反应。
为了实现低成本的制造，寡核苷酸合成酶已被配制成无细胞提取物，以避免昂贵的纯化步骤。当针对这些反应类别时，应该考虑这种方法。
显然，寡核苷酸合成是一个复杂而具有挑战性的课题。到目前为止，这篇文章已经展示了阻滞剂如何通过单核苷酸添加合成，如何连接形成单链，以及如何连接形成双链。
许多其他的策略正在发展，其中底物或酶的固定化用于提高工艺性能。9
固定化模板已用于制造单链低聚糖(如图7所示)，Almac已证明了使用selectAZyme连接酶进行低聚糖组装的原理。
这些方法使用固定化技术，其中各种格式的固定化基板模板(阻断剂)在后续耦合之前引导阻断剂组装。
图7:固定化阻断剂用于组装两个互补的阻断剂，用于后续的选择酶连接酶介导的连接
或者，酶本身可能被固定化。图3概述了使用selectAZyme RNA连接酶进行单核苷酸延伸以产生特定的短单链片段。
同样的方法如图8所示，使用固定化RNA连接酶和碱性磷酸酶进行无模板单核苷酸添加。这提出了一种基于流动的生物催化工艺的前景，将酶固定在固体支架上并包装在柱中，作为批处理的一种进化。
图8:用于阻断剂合成的固定化选择酶连接酶和磷酸酶
无论采取什么策略来合成寡核苷酸，它都依赖于能够获得相关的构建模块。生物催化在这方面也有重要作用，例如调节磷酸盐基团的区域选择性引入，或解决立体化学要求。
当硫取代氧进入寡核苷酸主干时，就形成了一个手性磷中心。如果寡核苷酸中存在多个硫残基，则存在多个非对映体产物的可能性。
通过分解外消旋磷酸键结合的二聚体混合物可以解决这种手性问题(如图9所示)。
图9:酶介导的二聚体分解
选择性水解生物分解可由磷酸二酯酶、磷酸三酯酶和磷酸酰胺酶催化。
为了准备下一代寡核苷酸，其中需要单一异构体，Almac一直在开发这些酶类的面板，并从自然中获得关于有机磷除草剂的微生物降解的灵感，以协助和指导酶面板的设计。
这三类酶已经克隆和筛选集合可用来满足良好的立体化学控制的需要。
当单链产物被酶延长时，可能需要去除一个磷酸基以进行下一阶段的酶延长。
碱性磷酸酶是在选择性和温和的条件下切割不受保护的磷酸盐的酶(如图3所示)。Almac已经开发了一组96种不同的磷酸酶用于这种类型的反应。
磷酸二酯骨架和核糖环的修饰已被概述为提高寡核苷酸治疗性能的策略。
另一种类型的修饰发生在碱基中，例如，可能需要甲基化。生物催化为这种改性底物提供了一条合成途径。
嘌呤和嘧啶核苷磷酸化酶可以将天然碱交换为非天然碱，如图10所示。Almac已经组装了不同的嘌呤和嘧啶核苷磷酸化酶(PNPs)面板，在需要非自然碱基时协助构建核苷积木。
图10:应用PNPs制备核苷
与寡核苷酸链合成一样，积木合成通过各种酶筛选板得到极大的帮助;这允许针对给定目标快速评估多条路线和综合策略。
寡核苷酸可能基于DNA而不是RNA，因此需要不同的合成方法。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是一种特殊的DNA聚合酶，它不需要模板，并将单核苷酸三磷酸(NTPs)添加到寡核苷酸或DNA分子的3 '端。
这与上面展示如何将较大的片段连接在一起的示例形成对比。如果供体NTP被阻断，例如使用3 ' - o -烯丙基或3 ' -氨基氧基，则可以通过TdT将其添加到寡核苷酸上……但阻断基团阻止了酶任意进一步添加NTP。
该产物可以被释放，循环重复，这样DNA链就会生长，如图11所示。这种开创性的方法可能会成为未来酶促寡核苷酸合成器的基础，而且，随着时间的推移，也可能适用于非天然的基于dna的寡核苷酸。
图11:应用TdT酶组装DNA
对寡核苷酸作为治疗手段的需求不断增加，人们的注意力集中在它们的合成方法上。使用磷酸酰胺的化学途径在产品的产量和纯度方面存在缺陷，这引起了人们对生物催化方法的极大兴趣。
酶在药物合成中具有可持续性、选择性和降低成本的优点。寡核苷酸(及其构建模块)有多种合成策略，这些产物总是具有相当大的结构复杂性。
因此，酶的合成需要一套复杂的酶技术来有效地解决构建块和链的构建。Almac开发了一系列生物催化产品和服务，以促进生物催化寡核苷酸合成的挑战，我们可以期待在未来几年出现壮观的成功故事。
生物催化技术已被证明有能力为现有工艺节省硬成本，或为制药部门提供经济的NCEs，确保了该领域的投资逐年增加。10
有大量的寡核苷酸通过创新者的管道，它们都需要临床试验的材料。随着这些产品在管道中移动，将需要更大的数量，这对现有的固相能力造成了巨大的压力。
现在是时候考虑替代方法，并在低聚物合成中获得酶催化的好处。这里展示的工作不仅缓解了产能压力，还开辟了新的合成路线，并改善了难以净化的产品的外观。现在是时候为你的寡核苷酸项目解锁酶的力量了。
参考文献
8.www.chemicalsknowledgehub.com/article/14595/。
9.r·穆林和t·s·穆迪，化学与工程新闻97， 34-35(2019)。
10.T.S.穆迪和S.米克斯，特种化学品杂志， 22-25，(2019年2月)。
欲了解更多信息
吉尔·卡斯维尔，达伦·格雷，丹尼尔·f·a·r·杜拉多和史蒂夫·泰勒，阿伦化学公司，汤姆·穆迪，阿尔马克科学公司。
