抗菌素耐药性(AMR)是科学界和医学界几十年来一直警告公众的一个严重问题。已经35年没有新的抗生素了，制药商也没有真正有效的动力去开发它们，这使得这一威胁更加紧迫。正如COVID-19大流行所表明的那样，做好准备可以挽救无数人的生命和世界经济
黑死病是一种腺鼠疫，在4年内夺走了近三分之二的欧洲人口，目前全球每年仍有3000例病例。
幸运的是，抗生素可以在2-5天内成功治疗大多数病例，就像抗生素可以帮助避免从常规智齿拔牙到器官移植和化疗等各种感染一样。然而，SCIEX研发副总裁克里斯·洛克(Chris Lock)写道，这一切都可能改变。
欧盟委员会今年正在审查其药品政策框架，世界各国领导人在上次七国集团峰会上宣布了应对抗生素耐药性的承诺。1、2
科学界不能对快速开发新抗生素抱有不切实际的期望，必须把重点放在对抗抗生素耐药性上，这一任务需要更好、更快地分析感染情况，以便更准确地进行抗生素治疗，以避免进一步的疾病和增加耐药性。
这样做还将有助于恢复欧洲在发现、开发和提供新的诊断方法、疗法和疫苗方面的创新领导者地位。
除了开发新方法来加速抗菌剂的发现和开发外，研究人员还在研究如何更好地优化现有治疗方法的应用，以对抗微生物疾病。
法国里昂分析科学研究所教授Jerome Lemoine博士正在研究如何改进诊断工具，以帮助临床医生在治疗威胁生命的感染(如由甲氧西林耐药性引起的感染)时做出更明智的决定金黄色葡萄球菌(MRSA)，可导致败血症和呼吸机相关肺炎(VAP)。3，4
图1:计划MRM算法。利用每种分析物洗脱时间的知识，所有MRM过渡仅在较短的保留时间窗口内进行监测。这允许在单个LC运行中监测更多的MRM转换，同时仍然保持最大的停留时间和优化的循环时间9
Lemoine教授与法国里昂平民医院(Hospices Civils de Lyon, Hôpital de la Croix Rousse)的François Vandenesch教授合作，正在开发一种新的分析方法，以了解和加速从临床样本中鉴定细菌，包括毒性和任何抗微生物药物耐药性的特征。3，4
MRSA通常是一种医院获得性或“医院”感染。2019年，它在全球造成了10万多人死亡，它只是抗生素耐药性存在的众多致病菌之一。5
2019年，全球约有127万人死于细菌性抗生素耐药性，另有368万人死于细菌性抗生素耐药性。5医院感染如败血症和VAP是由许多这些致病菌引起的。
确定导致疾病的细菌种类可能需要时间，而确定特定菌株是否对特定抗菌素敏感或耐药则需要更长的时间。3，4
图2:使用预定MRM与scout触发MRM的氧乐果。时间计划的MRM和Scout触发的MRM之间的数据质量具有可比性，其参数包括峰面积、离子比和跨半高度的点。在时间计划的MRM跟踪中，保留时间的轻微变化有可能使该峰值被切断或错过(左)，使样品无法使用并需要重新注入。相比之下，Scout触发MRM峰值安全测量，自动调整保留时间偏移8
患者通常使用广谱抗生素进行经验治疗，因为需要尽快开始治疗;然而，这种做法会增加选择多重耐药细菌的风险。4
因此，确定每个患者病例中的细菌，确认诊断并使用已知对该细菌菌株最有效的抗菌素进行治疗至关重要。3，4
大约50%的服用抗生素的患者一开始就被开错了药，而且没有正确地鉴定致病细菌。6细菌鉴定和特性鉴定仍然需要快速、可靠和负担得起的技术和工作流程，包括抗微生物药物敏感性测试(AST)。3、4、6
为了帮助满足这一需求，Lemoine教授花了数年时间开发质谱方法，可以从各种临床样本(医院捐赠的)中提供快速和明确的细菌分析。3、4、7质谱(MS)已经成为临床微生物学中细菌特征的金标准技术。3，4
Lemoine教授与SCIEX的科学家一起开发了一种使用质谱和液相色谱(LC)的快速工作流程，以期有朝一日将其应用于临床。该方法使用软件算法来获取基于被称为Scout标记化合物的分析物触发物检测的分析数据。7
该算法正被纳入现有的质谱技术:多反应监测(MRM)。MRM是一种高度特异性和敏感性的MS操作模式，用于有针对性的定量分析，使用串联质谱(MS/MS)与LC。8
Lemoine教授正在使用有针对性的定量LC-MS/MS分析，因为这是一种具有足够选择性、灵敏度和可靠性的多种方法，可以从生物样品中识别和表征细菌-在一次运行中提供丰富的信息。
为了量化每个样品和每次运行的目标分析物数量的增加，科学家将保留时间纳入MRM方法，因此可以在不影响数据质量的情况下捕获整个分析物组。8使用预定的MRM，分析物被分配保留时间，在此期间，质谱仪扫描预计从LC柱洗脱的分析物。
通过增加保留时间的时间表，灵敏度和选择性得到了提高，并且在一次采集中可以针对的分析物的数量增加了。8
这种被广泛采用的定时MRM策略允许在单个方法中分析数百甚至数千个转换，同时为定量数据质量保持合理的周期和停留时间(图1)。8、9
图3:侦察触发MRM分析的原理。侦察触发的MRM使用标记依赖的转换来触发一组依赖目标分析物的MS分析。依赖于标记的转变通常在色谱运行中交错，依赖的分析物根据其保留时间相关联。结果是一种对保留时间变化具有鲁棒性的靶向分析8
当对大量MRM转换的获取进行时间调度时，保留时间窗口也变得更窄，以保持数据质量。这就要求MS操作员在整个采集过程中，对许多样品和很长一段时间持续监测结果。
色谱系统的微小变化——如流动相组成、梯度长度和柱相——会导致保留时间的变化。因此，一些分析物的预期峰值偏离了预定的保留时间窗口，导致分析物峰值无法获得(图2)。8
没有获得的每个目标峰值必须在另一次运行中重新获得。这些回注和调整保留时间所需的人工调整每年花费实验室数千美元的仪器时间、宝贵的样品量和更高的操作人力资源。8
还需要开发更快的分析方法，从而更快地进行临床分析;迟迟不能发现细菌感染，从而无法进行最佳抗生素治疗，会恶化患者的预后，增加医疗保健支出。3、4、10 11
Lemoine教授和Vandenesch教授与SCIEX合作，提出了一个改进MRM的新概念，并开发了一种创新的、更快的MRM方法。侦察触发MRM (stMRM)无需为所有分析物保持准确的保留时间窗口。8
相反，stMRM依赖于Scout标记化合物，用于提供标记依赖的转变，从而触发依赖mrm的获取(图3)，这意味着尽管有任何意外的保留时间变化，但每个目标分析物峰值都被捕获。8
有了stMRM，科学家们有了一种新的MRM模式，可以用触发阈值编程，用于依赖标记的转换，以定义采集窗口何时开始(图4)。8确切的预期留存时间不再需要提前确定。然而，洗脱顺序现在是一个关键因素。8
该操作模式的用户界面内置了重叠保留时间窗口的编辑功能。一个依赖于标记的转换，如果它在获取窗口的边界附近洗脱，那么如果它在该窗口之外洗脱，则可能会错过其触发器。
图4:MRM转换在整个色谱时间尺度的采集窗口中触发。用户可以对依赖于标记的转换的触发阈值进行编程，以定义窗口开始的时间。洗脱顺序是关键，精确的保留时间不再是必要的8
为了解决这个问题，科学家们可以应用一个保留时间重叠函数，并对每个依赖于标记的跃迁应用一个容差，这样任何在此容差范围内洗脱的相邻跃迁都将由该标记触发。例如，通过设置这个容差，依赖转换可以由它自己的用户分配的标记触发，也可以由下一个或上一个标记触发。8
与计划的MRM算法相比，Scout触发MRM策略可以更好地优化采集窗口，以捕获所有目标分析物，同时在特异性、灵敏度、稳健性和数据质量方面保持相同的高标准(图5)。
虽然这项创新的新技术今年夏天才开始商业推广，但Lemoine教授和SCIEX已经成功地评估了stMRM的分析有效性，方法是量化和评估针对致病性感染和环境应激的免疫反应的候选蛋白质组生物标志物，以及筛选地表水中的多残留农药。12 - 14
Lemoine教授和Vandenesch教授继续致力于提供概念证明，以验证LC-MS/MS MRM方法，以快速识别和表征临床样本中的致病菌，包括AMR菌株。3、4、15
例如，他们成功开发了一种MRM方法，可以在60-80分钟内进行微生物鉴定、抗生素耐药性检测和毒性评估，并提供流行病学分型信息。3.
他们还开发了一种原型LC-MS/MS-based靶向蛋白质组学分析，使用MRM从VAP患者的气管内吸入样本中快速识别和表征致病菌。4
与基于pcr的基因分型等其他方法相比，这样的分析可以在一次分析中从生物样本中提供更多的可操作信息。一旦这一概念得到验证，这些检测方法就可以通过适当级别的设备和试剂进行改进，以过渡到临床环境中。
图5:测试Scout的稳健性触发MRM方法以应对各种色谱挑战。尽管LC系统进行了更改，如添加延迟列、更改实验室和改变流速，但scout触发的MRM工作流能够触发和检测目标分析物。该工作流程可以克服影响留存时间的常见方法调整，而无需重新构建获取方法8
这种数据丰富的工具还可以从细菌鉴定和分析工作流程中节省大量时间。3，4因此，医生和患者可以更早地就使用哪种抗菌治疗来对抗感染做出更明智的决定。
随着世界卫生组织(世卫组织)正式宣布抗生素耐药性为人类面临的十大全球公共卫生威胁之一，我们必须采取多种战略，通过使用有效药物准确和快速地治疗感染，消除或从根本上减少抗生素耐药性。16
今天，Lemoine教授的最新研究使用stMRM监测300个特征肽，以特异性识别脓毒症涉及的病原体。15该方法可以在短短8分钟内分析300个多肽。15虽然还没有准备好临床应用，但这项研究可以帮助改进临床诊断测试，以支持在短短3年内为患者精确处方和规范使用抗生素。15
参考文献
