病毒侵入宿主细胞，劫持它们的细胞机制，以指导自身基因组的复制和转录。OXGENE的科学传播和营销经理Sophie lutt博士报告说，这使它们成为危险的病原体，同时也是将新DNA运输到宿主细胞并确保其被转录的理想信使
先进的疗法制造商已经抢占了自然赋予他们的先机，利用基因工程、计算生物学和生物信息学的发展，完善了病毒颗粒作为治疗性DNA的载体，加速了突破性新疗法的临床成功。
在这里，我们研究了病毒生物学的三个方面，这些方面使它们成为基因治疗的有效运载工具，以及生物学家利用这些特性来提高临床表现的一些方法。
在正常的生理条件下，保持细胞间通信的开放通道对于营养物质的运输、信号转导和其他形式的细胞-细胞相互作用是必不可少的。
病毒善于利用这些通道搭便车进入细胞。例如，腺相关病毒(AAV)通常被用作基因替代疗法的载体，通过与细胞表面受体相互作用进入宿主细胞，导致网格蛋白包被的凹坑内吞。
从那里，pH值的变化触发病毒从核内体释放，在那里它被迅速贩运到细胞核。1
病毒感染哪些细胞以及如何有效地进入这些细胞取决于它与之相互作用的特定细胞表面受体。这被称为病毒趋向性。
到目前为止，在人类细胞中发现了9种不同的AAV血清型，在非人类灵长类动物细胞中发现了另外4种，每种都有不同的取向。2
第一个被发现的AAV是AAV2，它与几乎无处不在表达的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)结合，导致广泛的组织趋同性。3.
其他AAV血清型具有不同的细胞表面受体，因此具有不同的向性，这反过来又决定了每种基因治疗最适合的病毒载体的选择。
图1:将Tet阻滞剂结合位点插入到腺病毒基因组的MLP中，下游有一个TetR基因，引入了一个负反馈环，在没有强力霉素的情况下，腺病毒基因组不能转录任何编码结构蛋白的晚期基因
尽管不同的AAV血清型提供了不同的取向，但基因治疗载体的有效递送仍然是一个挑战。自然暴露于AAV意味着大部分人群已经产生了针对某些病毒血清型的中和抗体。
运送到目标组织可能很困难;例如，病毒载体的全身给药往往导致向肝脏的转运，这可能不是预期的目标。
进入目标组织可能是另一个挑战;病毒可能会“卡”在靶细胞外的细胞外基质上的热spgs和其他蛋白聚糖上。4事实上，任何特定的AAV衣壳对于特定的临床用途都可能有优点和缺点。
但是无论大自然给使用病毒载体进行基因治疗设置了什么挑战，科学都在努力克服它们——在这种情况下，通过衣壳工程来改善目标细胞类型的转导，提高转导的特异性和/或逃避宿主的免疫反应。
第一种方法，被称为理性设计，依赖于理解转导机制和识别病毒基因组中负责编码衣壳与细胞表面受体相互作用的区域。5
这允许将病毒基因组序列插入到另一种AAV血清型的基因组中，从而赋予所需的趋向性，这可能具有其他临床优势。
这种方法已经在一项针对杜氏肌营养不良症的临床试验中被证明是可行的，在该试验中，负责由AAV1有效转导骨骼肌的衣壳区域被改造成AAV2(其安全性更好，易于纯化)。6
然而，对于所有AAV血清型，病毒转导的确切机制尚不清楚，因此有时可能需要一种更随机的衣壳工程方法，称为定向进化。
这包括使用野生型帽基因作为起点来创建大型遗传文库——要么通过易出错的PCR将随机点突变引入帽基因，要么随机插入肽编码序列(例如编码已知细胞表面受体结合剂的序列)。
或者，突变可以针对衣壳的高变量区域，例如表面暴露的环，然后可以用生物信息学设计的肽序列取代。4由此产生的病毒颗粒可以在体外或体内被选择为所需细胞类型的转导。
病毒一旦进入细胞，就会熟练地夺取细胞DNA复制机制的控制权，迫使自己的基因组转录。当能够使病毒复制的基因在病毒颗粒内被治疗性转基因取代时，细胞被迫转录的正是这种DNA。
几乎所有的基因表达都由启动子驱动:DNA的核心区域，在调控基因上游约100个碱基对，加上上游激活序列或增强子。核心启动子区和增强子区都含有转录因子结合位点簇，这些区域的转录因子结合决定了基因的表达水平。
一般来说，无论是目标细胞/组织类型的内源性启动子还是病毒启动子都被用于驱动转基因表达。组织特异性内源性启动子具有限制靶细胞基因表达的优势;然而，通常低启动子活性或大启动子大小可能导致次优表达水平。
图2:分别用编码AAV基因组的工程腺病毒、AAV rep基因和cap基因感染HEK293细胞，产生AAV
相比之下，病毒启动子是组成性活性的，在所有转导细胞中导致高水平的治疗性转基因表达。由于转基因过表达或抗原提呈细胞内转基因表达刺激免疫反应，这具有毒性风险。7
因此，工程启动子驱动转基因表达代表了另一个机会，以提高临床性能的病毒载体。
易出错的PCR可以再次用于在启动子序列中插入随机点突变，以改变转录因子结合位点和改变启动子强度。然而，这种方法最有可能阻止转录因子结合，从而降低启动子的强度。8
虽然这可能会降低与病毒启动子转基因过表达相关的风险，但它不会阻止非特异性基因的表达。相反，通过筛选不同启动子和增强子组合文库构建的混合启动子可能是产生组织特异性启动子并提高转录强度的更好选择。8
基因治疗的制造依赖于利用细胞作为微型病毒生产工厂来生产大量的病毒载体。然而，aav的一个特性使它们成为基因治疗的理想载体——它不能在没有第二种病毒的帮助下复制——给它的制造带来了挑战。
在本质上，这种帮助是由腺病毒提供的……但这不是一个容易被用于临床生产的系统，因为腺病毒必须从AAV中纯化出来才能适合临床使用(一个复杂而昂贵的过程)。
迄今为止，生产用于临床的AAV所必需的腺病毒帮助是由编码腺病毒基因组的质粒提供的，该质粒已被削减到只有那些对AAV复制至关重要的基因。然而，这还远远不是一个理想的过程，基于质粒的AAV大规模生产的复杂性和成本已经被广泛报道。
相比之下，腺病毒一旦控制了宿主细胞系统，就能非常高效地复制自己。事实上，在腺病毒感染后，几乎90%的宿主细胞的mRNA来源于腺病毒基因组。
在这里，病毒载体工程提供了一个机会，利用腺病毒蛋白生产的力量，并利用它来改善细胞和基因疗法的制造。
在这种情况下，科学家们对腺病毒基因组进行了巧妙的两步操作。第一步是操纵基因组，使其仍能帮助AAV的产生，但不再转录腺病毒结构蛋白。
这是有效的，因为腺病毒基因组分为两个具有不同目的的时间阶段。所有负责帮助AAV复制的基因都是在早期转录的，而腺病毒结构蛋白都是在主要晚期启动子(major late promoter, MLP)的控制下从晚期基因转录的。
在MLP中插入Tet阻滞剂结合位点，并将Tet阻滞剂基因本身插入基因组的晚期区域，本质上削弱了腺病毒的产生;腺病毒越是试图转录其结构蛋白，它就会产生更多的Tet阻遏物来抑制MLP活性(图1)。
第二种操作包括将AAV代表和帽，或ITR两侧的治疗性转基因插入腺病毒基因组的早期阶段。现在，腺病毒基因组不能再产生腺病毒颗粒，但用这些编辑的腺病毒载体中的两个感染细胞足以产生大量的全功能AAV(图2)。9
野生型腺病毒和AAV共同进化，并对AAV的支持复制进行了微调，因此，基于质粒的AAV生产不能复制野生型腺病毒的AAV产量或质量，这也许并不奇怪。10
然而，这种腺病毒基因组工程方法保留了AAV生产的所有天然腺病毒辅助功能，这表明制造系统将产生比三次转染产生的更具传染性的AAV更高的产量。
在过去几年中，我们对病毒生物学和遗传学的了解呈指数级增长，操作它们所需的工具的可用性也呈指数级增长。
这导致了更强大的病毒载体的产生，可以针对特定的细胞类型，微调治疗性转基因在其中的表达，而且重要的是，这些新生物制剂的可获得性更大，质量更好，成本效益更高，更容易制造。
事实上，美国食品药品监督管理局预计，到2025年，每年将批准10-20种新的细胞和基因疗法，这表明我们正在进入一个新的基因医学黄金时代。
参考文献
