据报道，制药行业最近面临着可重复性危机，研究人员未能重现关键的药物研究结果。Bio-Rad实验室的Roumen Bogoev研究如何在西方印迹技术中改进这个问题
“亲爱的科学家,
我看了你的论文，有些坏消息要告诉你。在你使用的两种抗体中，第一种抗体不能用于免疫组化，它通过western blot给出假阳性数据。另一种也不能用于western或IHC，因为该抗体检测到的构象表位被固定破坏。”
因此，数十封给研究人员的信开始告诉他们，有缺陷和不可靠的抗体玷污了他们的研究。但问题的全面范围远远超出了几十份废纸。今年5月发表的一项研究表明，每年发表的临床前研究中约有一半是不可复制的1．研究指出，抗体是造成这种“可重复性危机”的主要原因。
抗体主要用于检测蛋白质，是药物发现、开发和特性研究中必不可少的工具。Western blotting，免疫组织化学(IHC)，免疫荧光(IF)，免疫沉淀(IP)，酶联免疫吸附试验(ELISA)等更多依赖抗体特异性来提供定性和定量的蛋白质特征数据。不幸的是，这种对抗体的依赖已经成为药物研发进展的主要障碍。
在对大约2万个抗体进行的特征分析中，瑞典一个旨在为整个人类蛋白质组生成抗体的联盟“人类蛋白质图谱”(Human Protein Atlas)确定，只有不到一半的抗体适合用于检测蛋白质定位2．2009年，一项针对49种用于识别g蛋白偶联受体(GPCR)的商业抗体的调查发现，大多数抗体是非特异性的，可以识别多种不同的受体3.．
这就引出了一个问题:有数百家抗体供应商，其中许多是不可预测的或完全不可靠的，企业如何能确保他们购买的抗体有效?在与许多研究人员讨论他们在寻求高质量抗体时所面临的挫折后，Bio-Rad开发了一系列最佳实践和购买和使用抗体的简单清单。
抗体行业的每一方——从资助机构到期刊再到研究人员——都对抗体不可重复性问题做出了贡献，但供应商可以做得更多，以提供可靠的产品。
抗体监督网站CiteAb的科学家和创始人Andrew Chalmers博士认为，抗体使用中的大量技术是供应商面临的一个关键挑战。“人们使用抗体的应用范围很广，也适用于不同的物种和组织。他说，公司永远无法验证一种抗体的所有这些用途。
即使是在标准的western blot中，也很少有数据可以证实公司声称的抗体可以可靠地检测靶蛋白
此外，很少有数据可以证实公司声称的抗体可以可靠地检测靶蛋白，即使是在标准的western blot中。Bio-Rad内容业务开发团队的高级科学家Mark Shulewitz指出，在供应商网站上，“在大多数或所有情况下，供应商倾向于只展示积极的数据，而不展示他们看不到任何表情的样本。他们也没有显示整个西方印迹;他们只裁剪出感兴趣的区域。”
抗体制造还有很长一段路要走，最大的迹象可能是批次对批次的可变性现象，尤其是在多克隆抗体方面。这些抗体是在活的动物体内产生的，依靠动物的免疫系统产生对目标蛋白质的抗体;然而，每一种动物都有独特的免疫系统，并会产生一组抗体，这些抗体可能是特异性的，也可能不是。当发现具有高特异性的抗体批次时，一些研究人员会为未来几年的研究储存抗体批次，因为他们意识到，尽管使用相同的目录编号，但新的批次可能包含性能较差的抗体库。
验证可以说是该领域最关键的词，但不同制造商的验证标准差异很大，对客户来说几乎没有透明度。
许多供应商会使用他们用来免疫动物的相同重组蛋白进行验证，无论是小鼠还是兔子
研究人员依靠抗体来检测细胞裂解物中数千种其他蛋白质中的一种特定蛋白质。抗体精密度的良好评估将在内源性背景下测试其特异性。不幸的是，许多供应商走捷径，使他们的抗体看起来比实际更特异性。舒莱维茨说:“从我们所看到的情况来看，许多供应商将使用他们用于动物免疫的相同重组蛋白进行验证，无论是小鼠还是兔子。”该策略将测试抗体是否检测到感兴趣的蛋白质，但不测试其在复杂样本中的特异性。
Subhash Verma博士是内华达大学里诺分校的分子微生物学和免疫学助理教授，在他的职业生涯中，他学会了密切关注供应商所做的验证捷径。例如，一些公司依靠过度表达目标蛋白来证明性能;然而，这并不总是转化为实际样本的性能。
维尔马说:“过表达抗体研究肯定会起作用，但供应商需要在总细胞裂解物上测试他们的抗体。”“如果这些被操纵的结果单独发表，研究人员就会忽视这样一个事实，即研究中的抗体可能不适用于标准或低蛋白表达的western blot。”
| 提高了western blot应用中抗体供应的标准 |
| 在西方免疫印迹法进入主流应用三十年后，由于抗体相关的问题，许多免疫印迹法仍然失败。在排除故障后，近三分之二的研究人员发现是抗体出了问题。一个科学家该如何与这些行业不确定因素谈判呢?Bio-Rad实验室是该领域的新参与者，他们提出了一个新概念——在广泛的样本上验证专门用于western blotting的抗体。 |
| Bio-Rad是一家成熟的western blot工具供应商;然而，该产品缺乏工作流程中的一个关键元素——初级抗体。2014年，该公司迈出了收购抗体提供商AbD Serotec的第一步。今年6月，Bio-Rad正式上线PrecisionAb该抗体产品线专门用于western blotting，以解决遍布抗体市场的关键挑战。 |
| Bio-Rad内容业务开发团队的高级科学家Mark Shulewitz说:“我们对我们的western blotting和电泳凝胶以及V3工作流程的所有这些部分拥有高度的客户信任。”他说，在我们确定能够提供客户期望的质量之前，我们不想进入抗体领域。 |
| 每个PrecisionAb抗体都在多达12种不同生物相关细胞系的全细胞裂解液上进行验证，远远超出了典型的少数样本，并且仅选择具有高灵敏度和特异性的内源性蛋白质检测抗体用于产品线。舒勒维茨说:“就批次之间的差异或可变性而言，我们对每一批进口的产品都进行了测试。”他说，必须要有新的产量，否则我们就不接受。 |
| PrecisionAb公司不会向尽可能广泛的市场投放数千种抗体，而是将重点放在经过western blotting严格筛选的特征良好的抗体上(见图1)。Bio-Rad公司将公布每个获批抗体的完整测试结果，包括阳性和阴性。舒莱维茨说:“看到这些结果，研究人员需要记住，阴性结果并不意味着蛋白质不存在，只是相对而言，蛋白质的含量少了很多。”“客户对样品中目标蛋白的相对表达水平有个概念，所以我们也会引导客户选择有效的样品。”此外，我们还提供了自己的阳性对照，以便客户可以验证他们所看到的结果与我们在Bio-Rad所看到的结果相同。” |
| 每个PrecisionAb抗体都配有完整的验证方案，帮助研究人员简化优化和验证，节省时间和试剂，并提供最佳结果。试验规模也适用于所有靶标，使研究人员能够测试抗体和优化实验条件，而无需大量的前期投资。积极控制包括，以方便目标波段识别以及故障排除，如果需要。 |
| 这些新产品提高了透明度和可靠性的标准，使我们有可能在一次交易中完成我们的供应商清单，并克服抗体质量不确定的挑战，可重复性和缺乏数据的特定western blot应用的可靠性。 |
图1:两种抗体验证数据。A:该碳酸酐酶IX (CA9)小鼠单克隆抗体因非特异性结合和低信噪比而未通过验证;B:该胸腺酸合成酶(TYMS)小鼠单克隆抗体通过验证，具有较高的特异性和敏感性
科学家如何利用可靠的抗体进行可重复的实验?首先，供应商需要是有效和高效的，在不使市场过于广阔的情况下尽可能彻底地验证。其次，考虑到许多无法控制的因素，科学家必须接受他们总是需要在内部进行最终验证的事实。
抗体可靠性方面的权威专家c·格伦·贝格利(C. Glenn Begley)博士在一家大型生物技术公司工作了10多年，并证实他的科学团队将尝试在内部进行验证。贝格利博士说:“我们看到了大量的差异，所以对每一批新的抗体进行验证是非常必要的。”
确保高性能抗体需要供应商复制将使用抗体的环境
确保高性能抗体需要供应商复制将使用抗体的环境。然而，大型制造设施并不总是能复制小型学术或工业实验室的条件。供应商可以通过使用beta测试人员和该领域的真正科学家来解决这些变量。
为了补充专门化，供应商还需要针对多个细胞系和样本类型广泛验证每个产品批次。这意味着测试他们的产品在不同水平的蛋白质表达、降解和背景抗原下的表现。
最终，科学家需要从提供其产品全面和完整特性的供应商那里购买。公司网站不仅应该公布所有阳性结果，还应该公布未检测到信号的测试结果。这些数据使研究人员能够判断给定的抗体是否会影响他们的研究，或者是否对特定的应用或样本类型不起作用。阴性样本列表也可以为其他样本提供阴性对照，这对于检测假阳性结果至关重要，这是任何正确进行的实验的重要组成部分。
从根本上说，好的抗体必须识别正确的靶标，脱靶结合应该是最小的。但是在购买之前如何保证这些标准呢?
首先，研究人员应该仔细检查供应商的验证数据，注意具体的验证方案以及是否针对内源进行测试。接下来，对引用该抗体的期刊进行调查，通常会很好地说明该抗体检测感兴趣蛋白质的能力。然而，由于在同行评审期刊上发表的许多论文中使用了未经验证和非特异性抗体，引用有时可能具有误导性。因此，读者不应该仅仅因为多个小组使用了某种抗体，就认为它得到了正确的验证。
此外，第三方网站正在帮助整理证据。CiteAb就是一个很受欢迎的例子，它列出了200多万个抗体，每月有1.5万独立访问者。F1000是另一个可用的资源，为科学家提供抗体验证结果和同行评议的数据，但它的次要作用是强调经常被忽视的验证步骤的重要性。
在抗体制造商收集证据证明他们的产品在一个方便的地点工作之前，在考虑购买时有必要咨询多个来源。
图2:PrecisionAb小鼠抗cdk7抗体在12个全细胞裂解物上测试
对一种抗体进行再多的研究也不能保证它适用于任何公司的特定应用。这意味着内部验证至关重要。例如，western blot中蛋白质的含量和抗体的稀释度都是必须在各个实验室中确定的因素。幸运的是，一些公司为内部验证目的提供试验规模的抗体。
抗体供应商必须在严格的验证和相关成本之间保持平衡
维尔马说:“我们首先做了一个测试，以确定它是否能抓住目标，以及它的分子量是否合适。”当这种方法不起作用时，他鼓励实验室里的科学家坚持验证。“我告诉他们:‘用不同浓度的蛋白质来更好地了解抗体的特异性。如果不行，那就试试不同的稀释度。”有时候加入太多抗体可能会产生太多背景噪音。或者如果你没有得到任何结合，那就增加你添加的抗体的数量。”
抗体验证需要时间，抗体供应商必须在严格的验证和相关成本之间保持平衡。在公司能够提供更可靠的验证数据之前，选择抗体的最佳做法可以归结为:避免整个行业的许多陷阱，从数据透明的供应商那里购买，并在内部进行严格的验证。
1.石油醚弗里德曼et al。公共科学图书馆杂志。2015, DOI: 10.1371/journal.pbio.1002165
2.l·巴瑞et al。摩尔。细胞。Proteom。2008年,7, 2019年
3.节目主持人米歇尔et al。Naunyn-Schmiedeberg的拱门。杂志。2009年,379, 385年
PrecisionAb是Bio-Rad的注册商标
